Optimisation d'un haut

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 4588 (2023) Citer cet article

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Des outils sensibles pour détecter les sérotypes pneumococciques colonisateurs simultanés sont nécessaires pour une évaluation détaillée de l'impact direct et indirect de la vaccination systématique contre le pneumocoque conjugué (PCV). Un ensemble de réactions de PCR nanofluidique quantitative en temps réel à haut débit (Standard BioTools « Fluidigm ») a été développé pour détecter et quantifier 92 sérotypes de pneumocoques dans des échantillons cliniques archivés. Des écouvillons nasopharyngés prélevés en 2009-2011 sur des enfants sud-africains de ≤ 5 ans, préalablement sérotypés avec des méthodes standard basées sur la culture, ont été utilisés à des fins de comparaison. L'ensemble de réactions dans le «Fluidigm» a efficacement amplifié toutes les cibles avec une efficacité élevée (90–110%), une reproductibilité (R2 ≥ 0,98) et une faible limite de détection (< 102 UFC/ml). Une analyse en aveugle de 1 973 échantillons d'écouvillonnage nasopharyngé a montré une sensibilité diagnostique > 80 % et une spécificité > 95 % par rapport à la méthode Quellung standard de référence basée sur la culture. La méthode qPCR a permis de sérotyper les types de pneumocoque avec une bonne discrimination par rapport à Quellung (ROC-AUC : > 0,73). La méthode de PCR nanofluidique en temps réel à haut débit détecte simultanément 57 sérotypes individuels et 35 sérotypes au sein de 16 sérogroupes dans 96 échantillons (y compris les contrôles), au cours d'une seule analyse de qPCR. Cette méthode peut être utilisée pour évaluer l'impact des formulations actuelles de PCV sur la colonisation des sérotypes vaccinaux et non vaccinaux, y compris la détection de plusieurs sérotypes colonisant simultanément. Notre méthode qPCR peut permettre de surveiller la charge bactérienne spécifique au sérotype, ainsi que l'émergence ou la transmission continue de sérotypes mineurs ou co-colonisateurs qui peuvent avoir un potentiel de maladie invasive.

La capsule de Streptococcus pneumoniae est composée de polysaccharides répétés génétiquement codés par le locus Capsular Polysaccharide Synthesis (CPS) qui confère l'hétérogénéité des sérotypes1,2. Il existe 100 sérotypes biochimiques et sérologiques distincts de S. pneumoniae3. La diversité capsulaire est un facteur de virulence important chez S. pneumoniae4 et les sérotypes ont un potentiel différent de provoquer des maladies chez l'homme5. Les vaccins antipneumococciques conjugués (PCV) préviennent l'acquisition du portage du sérotype vaccinal antipneumococcique (VT), qui est un précurseur de la maladie6,7,8,9,10. Le premier PCV sous licence (PCV7) ciblait sept sérotypes, à savoir : 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F et 23F. Les PCV actuellement utilisés dans notre contexte comprennent trois sérotypes supplémentaires (PCV10 : 1, 5 et 7F) et six (PCV13 : 1, 3, 5, 6A, 7F et 19A). Les PCV 15- et 20-valents de nouvelle génération sont en cours d'essais cliniques et comprennent deux sérotypes supplémentaires (22F et 33F)11 et sept (8, 10A, 11A, 12F, 15B, 22F et 33F)12, respectivement, par rapport au PCV13.

La surveillance de la colonisation par les pneumocoques des voies respiratoires supérieures est utile pour évaluer l'impact de la vaccination contre le PCV au niveau de la population13. Les enquêtes de colonisation pneumococcique sont mieux réalisées en utilisant des méthodes de sérotypage complètes, sensibles et précises capables de détecter le co-portage de plusieurs sérotypes, y compris les sérotypes VT et non vaccinaux (NVT). Une surveillance cohérente des sérotypes en circulation est nécessaire pour éclairer les stratégies de vaccination et l'utilisation de PCV de valence supérieure ou alternative, y compris adaptés aux différentes régions géographiques ; et pour la détection de sérotypes émergents ou de remplacement13.

Les méthodes Quellung basées sur la culture restent l'étalon-or pour le sérotypage de S. pneumoniae ; cependant, ces méthodes prennent du temps, ont une faible sensibilité et sont coûteuses14,15. Par rapport aux méthodes basées sur la culture, la détection et le sérotypage basés sur la réaction en chaîne par polymérase (PCR) ne reposent pas sur la viabilité de l'organisme qui peut être affectée négativement par l'utilisation d'antibiotiques, le transport des échantillons et les conditions de stockage, prennent moins de temps, fournissent un diagnostic plus rapide et une sensibilité plus élevée15 . La PCR conventionnelle et en temps réel a été utilisée, y compris les PCR nichées et multiplexes à tube unique avec électrophorèse sur gel ou capillaire et combinées avec la détection par transfert de points, l'enrichissement de la culture et l'analyse basée sur le séquençage16,17,18,19,20,21,22, 23,24,25,26,27,28. Des méthodes de PCR en temps réel ont été développées avec un nombre croissant de sérotypes détectés21,29,30,31, y compris dans les systèmes à haut débit15,32,33. De plus, les méthodes de PCR quantitative (qPCR) qui sont validées pour déterminer la charge bactérienne29,31,32,34 sont importantes pour évaluer l'impact des vaccins dans les programmes de santé publique. Une charge bactérienne accrue dans le nasopharynx peut prédire le potentiel de maladie invasive spécifique au sérotype31.

Auparavant, nous avons développé un ensemble de réactions qPCR nanofluidique capable de détecter et de quantifier simultanément 55 sérotypes pneumococciques32, ainsi qu'une méthode de détection et de typage pour distinguer les sérogroupes 6A/B/C/D, 18A/B/C et 22A/F en sérotypes uniques35 en utilisant la même plateforme. Ici, nous développons notre méthode pour détecter et quantifier 38 sérotypes supplémentaires, permettant un sérotypage pneumococcique complet (92 sérotypes) et la détection de 15 autres espèces bactériennes pour évaluer la colonisation et la charge bactérienne dans les échantillons respiratoires.

Pour développer un ensemble de réactions complet pour le sérotypage de S. pneumoniae et la détection d'autres espèces pouvant être présentes dans le nasopharynx, au sein d'une plateforme de PCR en temps réel, nanofluidique, à haut débit, une revue de l'ensemble de tests publiés ( amorces et sondes) séquences a été réalisée. Les séquences GenBank FASTA représentatives des gènes capsulaires de sérotype 19B (CR931676) et 19F (CR931678), le gène de la protéine putative pneumococcique Xisco (NC_003028) et le gène d'encapsulation Haemophilus influenzae Bex (X54987) ont été alignés dans BioEdit à l'aide de l'alignement multiple ClustalW36,37. Des amorces standard et des sondes MGB marquées par un colorant ont été conçues manuellement pour détecter le gène de polysaccharide capsulaire 19F wzh pour différencier 19F de 19B1,2, pour détecter le gène pneumococcique Xisco et pour détecter le gène H. influenzae BexA. Toutes les séquences d'oligonucléotides organisées pour chaque ensemble de tests répertoriés dans le tableau supplémentaire S1 ont été analysées pour garantir la spécificité in silico à l'aide de l'outil de recherche d'alignement local de base (NCBI BLAST ; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) avant l'inclusion dans le jeu de réaction. La température de fusion (Tm) des oligonucléotides individuels dans chaque ensemble de tests a été déterminée à l'aide des outils en ligne Oligocalc38 et de l'OligoAnalyzer Integrated DNA Technologies (IDT) (http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/) pour évaluer leur aptitude à l'inclusion dans un profil thermique uniforme et au multiplexage. L'outil IDT OligoAnalyzer a été utilisé pour évaluer les structures secondaires et les sites d'auto-liaison. L'efficacité analytique (efficacité, sensibilité et spécificité) et la performance diagnostique (sensibilité, spécificité et concordance) de l'ensemble de réactions concaténées dans la qPCR en temps réel à haut débit nanofluidique (« Fluidigm », Standard BioTools) ont été établies par des calibrateurs et des échantillons cliniques respectivement.

Les souches témoins ont été cultivées selon des méthodes de culture de microtitrage standard pour quantifier leur densité relative en tant qu'unités formant colonies (UFC/ml) à utiliser comme calibrateurs de quantification et pour évaluer l'efficacité analytique. L'ADN total a été extrait et stocké à - 30 ° C jusqu'à ce qu'il soit dosé, comme décrit précédemment35. L'ADN de 89 isolats représentatifs des sérotypes pneumococciques inclus et de 15 autres bactéries a été utilisé pour optimiser les ensembles de tests PCR et évaluer la spécificité analytique des ensembles de tests par rapport à leurs cibles respectives (sérotypes pneumococciques : 1 ; 2 ; 3 ; 4 ; 5 ; 6A ; 6B ; 6C ; 6D ; 7A ; 7B ; 7F ; 7C ; 8 ; 9A ; 9L ; 9N ; 9V ; 10A ; 10B ; 10C ; 11A ; 11B ; 11C ; 11D ; 11F ; 12B ; 12F ; 13 ; 14; 15a; 15b; 15c; 15f; 16a; 16f; 17a; 17f; 18a; 18b; 18c; 18f; 19a; 19b; 19c; 19f; 20; 21; 22a; 22f; 23a; 23b; 23f; 24a; ; 24B ; 24F ; 25A ; 25F ; 27 ; 28A ; 28F ; 29 ; 31 ; 32A ; 32F ; 33A ; 33B ; 33C ; 33D ; 33F ; 34 ; 35A ; 35C ; 35F ; 35B ; 36 ; 37 ; 38 ; 39 ; 40 ; 41A ; 42 ; 43 ; 44 ; 45 ; 46 ; 47A ; 47F ; 48 ; Acinetobacter baumannii, Bordetella holmesii, B. parapertussis, B. pertussis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae-b, Haemophilus influenzae non typable, Klebsiella pneumoniae, Moraxella catarrhalis, Neisseria lactamica, Neisseria meningitidis, Staphylococcus aureus, Streptococcus algalactiae et Streptococcus pyogenes). Les isolats de contrôle ont été obtenus auprès du National Institute for Communicable Diseases (NICD), Afrique du Sud, du Murdoch Children's Research Institute (MCRI), Australie et du South African Medical Research Council Vaccines and Infectious Diseases Analytics Research Unit (Wits-VIDA), Soweto , Afrique du Sud.

Nous avons utilisé des fragments de gène de matrice d'ADN synthétique double brin (dsDNA) (gBlocks) comme calibrateurs externes (tableaux supplémentaires S2 et S3) pour l'efficacité analytique et la variation intra- et inter-essai. Les gBlocks contenaient des séquences pour chaque sérotype pneumococcique ou autre cible bactérienne selon le pool (tableau supplémentaire S4) dans lequel les ensembles de tests respectifs étaient inclus. Celles-ci ont été appliquées pour évaluer la sensibilité analytique (limite de détection) et la répétabilité (variation intra et inter-essai et tracés de Levy-Jennings) de l'ensemble de réactions. La conception, les propriétés et les séquences de chaque gBlock ont été détaillées précédemment35. En bref, pour chacun des trois pools (A, B et C, tableau supplémentaire S4), trois gBlocks ont été conçus (neuf au total) comprenant chacun neuf à treize régions cibles. Les séquences cibles dans gBlocks sont facilement quantifiées car il existe un rapport équimolaire de tous les modèles. La quantité d'ADN synthétique de gBlock a été mesurée à l'aide du Fluoromètre Thermo Fisher Invitrogen Qubit 2.0 Qubit 2.0 avec le kit de dosage Invitrogen Qubit dsDNA BR. Le nombre de copies, ou le nombre d'équivalents de gènes, a été calculé à l'aide de la formule :

Le montant était la moyenne des trois mesures Qubit qui a été multipliée par le nombre d'Avogadro (6,022 × 1023). La longueur en paires de bases a été multipliée par le poids moyen d'un nucléotide d'ADNdb (660 daltons ou g/mole) et reconvertie en ng (1 × 109).

De mai à octobre 2009 et de mai 2010 à février 2011, deux enquêtes sur le portage ont été menées à Agincourt, Mpumalanga et Soweto, Gauteng respectivement, pour évaluer la colonisation pneumococcique spécifique au sérotype au cours de la première phase d'introduction du PCV7 en Afrique du Sud qui a commencé en mai. 200939,40. Les isolats de chariots issus de ces enquêtes transversales ont été préalablement cultivés à l'aide de méthodes microbiologiques standard et sérotypés à l'aide de la méthode Quellung. Ici, nous avons inclus tous les écouvillons nasopharyngés archivés disponibles d'enfants âgés de 0 à 5 ans pour évaluer notre méthode de sérotypage pneumococcique dans les groupes d'âge où la colonisation pneumococcique était la plus élevée (Fig. 1). Rétrospectivement, tous les échantillons archivés, quels que soient les résultats de culture, ont été retestés avec 'Fluidigm', à moins que les échantillons ne soient épuisés ou qu'aucun résultat Quellung ne soit disponible, afin de valider l'ensemble de réactions pour un sérotypage précis dans les échantillons cliniques, comme indiqué sur la Fig. 1. Sur les 1973 échantillons cliniques archivés disponibles pour l'analyse actuelle, 69,2% étaient positifs pour le pneumocoque par culture.

Organigramme de validation décrivant les échantillons cliniques archivés inclus qui ont été précédemment sérotypés à l'aide de la méthode Quellung basée sur la culture et qui ont été comparés à la PCR quantitative et de sérotypage en temps réel "Fluidigm" de Standard BioTools. A09C indique des échantillons prélevés sur des enfants d'Agincourt (2009)39. S10C indique des échantillons d'enfants de Soweto (2010/11)40. Les échantillons étaient des écouvillons nasopharyngés archivés dans STGG comme décrit dans la section "Échantillons cliniques (écouvillons nasopharyngés) pour validation", qui ont été précédemment testés à l'aide de la méthode Quellung basée sur la culture39,40. Des échantillons cliniques archivés ont été utilisés pour évaluer les performances diagnostiques de la qPCR « Fluidigm ». Lorsque des échantillons étaient indiqués comme manquants/épuisés, ces échantillons n'étaient pas disponibles pour l'extraction d'acide nucléique car ils étaient soit épuisés par des tests précédents, soit le flacon d'échantillon n'était pas localisé. Lorsque les échantillons sont indiqués comme ayant échoué/épuisés, l'extraction de l'acide nucléique a échoué et il n'y avait pas suffisamment d'échantillon restant pour répéter cette extraction. Les échantillons de contrôle étaient des souches de culture utilisées pour évaluer les performances analytiques de la qPCR « Fluidigm » et sont décrits dans la section Méthodes « Extraction totale des acides nucléiques ». Tous les échantillons extraits et les contrôles ont été analysés dans le « Fluidigm », mais seuls les échantillons avec un résultat Quellung (positif ou négatif) ont été inclus dans les comparaisons des performances de diagnostic.

Les échantillons (NPS dans un milieu de transport lait écrémé-tryptone-glucose-glycérine [STGG]) qui ont été stockés à - 80 ° C ont été décongelés et vortexés à basse vitesse pendant 30 s. Les acides nucléiques ont été extraits de 400 µl de STGG et élués dans 100 µl de tampon d'élution à l'aide de la plateforme d'extraction d'acides nucléiques automatisée BioMérieux NucliSens easyMAG (BioMérieux, Marcy l'Etoile, France) selon les protocoles standard du fabricant. Un contrôle sans modèle (NTC) qui était un STGG vierge a été inclus dans chaque lot de 23 échantillons cliniques extraits. Les acides nucléiques ont été stockés à - 30 ° C jusqu'à ce qu'ils soient dosés.

L'amplification de cible spécifique (STA) a été effectuée conformément aux recommandations du fabricant comme étape initiale (pré-amplification de l'ADN) pour le système Biomark HD (Standard BioTools, anciennement Fluidigm) comme indiqué précédemment35. En bref, les ensembles de tests (amorces uniquement) ont été séparés en trois pools multiplex STA (tableau supplémentaire S3) pour éviter toute réactivité croisée des amorces. Après STA, la qPCR a été effectuée sur le circuit fluidique intégré (IFC) Standard BioTools 96.96 Gene Expression (GE) Dynamic Array (numéro de produit BMK-M-96.96) ou sur le Flex Six 12.12 GE IFC (numéro de produit 100-6308) contre un ensemble de réactions qui combine 96 échantillons avec 96 ensembles de tests pour 9 216 réactions qPCR individuelles par matrice ou 12 échantillons avec 12 ensembles de tests pour 144 réactions par matrice, respectivement. Un organigramme de la préparation et du chargement des BioTools standard ("Fluidigm") 96.96 IFC est détaillé dans la Fig. S1 supplémentaire et a été décrit en détail précédemment35. En bref, pour chaque échantillon, le produit STA de chacun des trois pools (5 µL) et 10 µL de H2O de qualité moléculaire ont été combinés, pour diluer les amorces restantes. Par la suite, le prémélange de test pour chaque cible a été aspiré dans les entrées de test IFC pour une concentration finale d'amorces de 9 µM et de sonde de 2,5 µM par réaction et échantillons (2,25 µL de produit STA regroupé, 2,50 µL Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Master Mix, numéro de catalogue 4370074 et 0,25 µL de réactif de chargement d'échantillon Standard BioTools/Fluidigm) ont été aspirés dans les entrées d'échantillon. L'IFC a ensuite été exécuté dans le thermocycleur BiomarkHD, en utilisant les conditions de cyclage thermique fournies par le fabricant : 50 °C pendant 2 min, 70 °C pendant 30 min, 25 °C pendant 10 min, 50 °C pendant 2 min, 96,5 °C pendant 10 min suivi de 40 cycles de 96 °C pendant 15 s, 60 °C pendant 60 s. Les résultats ont été analysés à l'aide du logiciel Fluidigm Real-time PCR Analysis. Ici, les seuils ont été définis manuellement ; la ligne de base a été automatiquement attribuée et une valeur seuil du cycle de quantification (Cq) de 38 a été appliquée.

Des courbes d'étalonnage de régression (courbes standard) ont été préparées pour chaque ensemble de tests en utilisant des dilutions en série de dix fois en double des souches témoins positives ciblées ou gBlocks. Les courbes standard comprenaient cinq points de données ; les valeurs aberrantes à la fin de la plage qui ne contenaient pas de valeurs de cycle linéaire de quantification (Cq) ont été supprimées pour définir la plage dynamique linéaire et la valeur du coefficient de détermination (r2). À une concentration élevée de matrice, les inhibiteurs de PCR sont à une concentration plus élevée, alors que dans les échantillons hautement dilués, la liaison stochastique entraîne une variabilité de l'amplification. Une matrice concentrée ou diluée, ou des erreurs de dilution affecteront donc l'efficacité de l'amplification, entraînant des valeurs Cq imprévisibles. Les valeurs qui se situent en dehors de la limite de linéarité ne sont plus prédites par l'équation linéaire. Pour cette raison, les valeurs aberrantes sont exclues. L'efficacité (%) pour chaque ensemble de tests inclus a été dérivée de la pente (m) de l'équation linéaire (y = mx + c) générée à partir des courbes standard à l'aide de l'équation :

Une série de dilutions en triple de souches bactériennes témoins ou gBlocks à l'extrémité inférieure de la plage dynamique linéaire (103 à 100 copies par µL) a été utilisée pour déterminer la sensibilité analytique ou la limite de détection (LOD) définie comme la plus faible UFC/mL ou copies détecté en triple exemplaire de 'Fluidigm' qPCR. Une bibliothèque d'ADN a été préparée des sérotypes pneumococciques ciblés ou d'autres espèces bactériennes à une moyenne de 103 à 104 UFC/mL. La spécificité analytique a été évaluée en comparant la bibliothèque d'ADN à chaque ensemble de tests dans la qPCR « Fluidigm ».

Pour les ensembles de tests qui se trouvaient dans les plages d'efficacité prescrites (90 à 110 %), la quantification relative de la densité bactérienne a été extrapolée à l'aide de l'équation linéaire générée à partir des courbes standard des calibrateurs (souches témoins et gBlocks de densité connue) à l'aide de l'équation :

Lorsque plus d'un ensemble de tests a détecté ou déterminé un sérotype, la densité moyenne a été calculée. Par exemple, pour calculer la densité du sérotype 6A :

La densité relative entre les sérotypes a été utilisée pour établir une hiérarchie dans le portage simultané de plusieurs sérotypes, les sérotypes primaires étant ceux ayant la densité la plus élevée et les sérotypes sous-dominants ou co-colonisateurs étant ceux ayant une densité relative plus faible. Des parcelles de Bland-Altman (différence par rapport aux moyennes) ont été construites pour comparer la densité de LytA à PiaB, et pour comparer la densité moyenne de pneumocoques (LytA et PiaB) à la somme de la densité de sérotypes par échantillon.

La sensibilité diagnostique a été évaluée par une nouvelle analyse en aveugle des échantillons cliniques stockés (n = 1973 ; Fig. 1) qui ont été préalablement cultivés et sérotypés à l'aide de la méthode Quellung. Les échantillons ont été retestés avec l'ensemble de réactions qPCR dans l'IFC 96,96 qui comprenait le NTC extrait et les calibrateurs de quantification (gBlocks répertoriés dans les tableaux 2 et 3, ou souches de contrôle à 104 et 103 UFC/mL). Le test de McNemar a été utilisé pour comparer la détection du sérotype dans le jeu de réactions qPCR avec celle de la méthode Quellung. Les échantillons devaient être positifs pour les deux gènes de référence pneumococciques LytA et PiaB pour se voir attribuer un sérotype positif. Lorsque ces gènes pneumococciques n'ont pas été détectés, mais qu'un ensemble de tests spécifiques au sérotype était positif, aucun sérotype n'a été attribué. La désignation de sérotype par la qPCR «Fluidigm» et Quellung était considérée comme différente lorsque les valeurs de p étaient ≤ 0,05. Le coefficient kappa de Cohen a été utilisé pour déterminer la concordance spécifique au sérotype de la qPCR « Fluidigm » et de Quellung par échantillon clinique. Les valeurs de Kappa < 0,20, 0,21-0,40, 0,41-0,60, 0,61-0,80 et 0,81-1,00 ont été considérées comme un accord faible, moyen, modéré, bon et excellent, respectivement. Les analyses ont été effectuées dans Stata version 13.0, y compris l'application d'algorithmes pertinents pour l'attribution des sérotypes.

La répétabilité (variance intra-essai) a été déterminée à l'aide de l'écart type (SD) pour la variance de Cq des gBlocks exécutés en triple dans le même IFC à 103 équivalents de gène. La reproductibilité (variance inter-essai) a été définie comme l'écart type de la variance Cq pour les gBlocks entre quatre IFC différents.

L'approbation éthique a été obtenue auprès du Medical Human Research Ethics Committee (HREC) de l'Université de Witwatersrand pour le prélèvement initial de l'échantillon (Soweto Cohort HREC : M090115 ; Agincourt Cohort HREC : M090114). Un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les tuteurs légaux des participants dans le cadre de l'étude originale dans laquelle des échantillons ont été obtenus. Les méthodes moléculaires et l'utilisation d'échantillons dans cette analyse ont été approuvées par le HREC de l'Université de Witwatersrand (HREC : M170314). Toutes les méthodes ont été réalisées conformément aux directives et réglementations locales et internationales pertinentes en matière de bonnes pratiques cliniques.

Au total, 96 ensembles de tests ont été inclus dans l'ensemble final de réactions qPCR « Fluidigm ». La qPCR a pu détecter 92 sérotypes pneumococciques et les différencier en 35 sérotypes dans 16 groupes et 57 types individuels et identifier 15 autres espèces bactériennes (Fig. 2, Tableau supplémentaire S4).

Web récapitulatif des 92 sérotypes pneumococciques (57 sérotypes individuels et 35 sérotypes au sein de 16 sérogroupes) détectés par le jeu de réactions « Fluidigm ». Surlignés en gris sont les sérotypes PCV7 : 4, 6B, 9A/V, 14, 18C, 19F et 23F ; Sérotypes PCV10 : sérotypes PCV7 et 1, 5, 7A/F ; Sérotypes PCV13 : sérotypes PCV10 et 3,6A, & 19A. NVT : sérotypes non inclus dans le PCV13.

L'efficacité d'amplification dans l'ensemble de réactions était excellente pour 91 ensembles de tests qui se situaient dans la plage prescrite de 90 à 110 % (tableau 1). Pour ces ensembles de tests, les points de données ont été prédits avec précision par l'équation linéaire des courbes de régression (r2 > 0,98, tableau 1), permettant une quantification relative de la charge bactérienne à l'aide de la pente de l'équation linéaire. La plage dynamique linéaire pour ces ensembles d'essais était d'au moins 5 fois le log. En outre, les tracés de Levy-Jennings construits à l'aide de calibrateurs de référence spécifiques à l'ensemble de tests se situaient à ± 2,0 SD de la valeur moyenne de Cq sur toutes les plaques. Cela a validé l'utilisation des calibrateurs conçus (gBlocks). Les ensembles de tests pour la détection d'E. coli, Pneumocystis jiroveci, S. algalactiae, le gène Xisco de S. pneumoniae et le gène de l'ARN ribosomal bactérien 16S (énumérés dans le tableau supplémentaire S1) n'ont pas bien fonctionné dans cet ensemble de réactions, car l'efficacité était < 90 % ou > 110 % ou r2 < 0,98 (tableau supplémentaire S5).

La sensibilité analytique était élevée pour 91 ensembles de tests inclus (LOD : 10 à 100 équivalents de gènes, tableau 1). Les ensembles de tests ont été exécutés de manière cohérente, avec des valeurs Cq de répliques (n = 3) amplifiées simultanément dans une plaque de réaction (intra-essai) ou dans des plaques de réaction consécutives (inter-essai) à ± 0,1 SD de la moyenne. Sur les 96 ensembles de tests de la qPCR « Fluidigm », 94 ensembles de tests étaient spécifiques à leurs calibrateurs de contrôle bactériens ciblés, et aucune réactivité croisée n'a été observée entre les ensembles de tests. Deux séries de réactions, à savoir 10A et 33B, ont détecté d'autres sérotypes au sein du même groupe, c'est-à-dire 10B et 33C respectivement. Ces ensembles de tests ont donc été renommés en conséquence : 10A a été renommé 10A/B et 33B a été renommé 33B/C. Un algorithme de sérotypage basé sur le schéma de détection de tous les ensembles de tests contre toutes les souches bactériennes ciblées a été appliqué pour disséquer certains sérotypes individuels, à savoir : 6A, 6B, 6C, 6D, 10A, 11E, 12A/F/44, 18A, 18B, 18C, 18F, 19B, 22A, 23A, 38, 37, 33AF, 35F, 47A, 47F, S. pneumoniae non typable, H. influenzae non typable, H. influenzae non typable, B. pertussis, B holmesii et B. parapertussis (tableau 2). Les ensembles de tests pour les sérotypes 10B et 33C avaient été inclus dans l'ensemble de réactions et, par conséquent, la spécificité de l'attribution des sérotypes par l'algorithme n'a pas été affectée par les sérotypes à réaction croisée, car 10A et 33B n'ont pas été détectés par ces ensembles de tests respectifs. Par exemple, le sérotype 10A serait détecté par l'ensemble de tests 10A et non par l'ensemble de tests 10B et serait donc attribué au sérotype 10A ; tandis que le sérotype 10B serait détecté par l'ensemble de tests 10A et l'ensemble de tests 10B et se verrait donc attribuer le sérotype 10B.

Comme les performances diagnostiques ont été comparées à la méthode Quellung, celle-ci n'a été appliquée qu'aux sérotypes pneumococciques. En outre, les performances diagnostiques du « Fluidigm » n'ont pas pu être évaluées pour les ensembles de tests qui ciblaient des espèces bactériennes ou des sérotypes de pneumocoques qui n'avaient pas été détectés auparavant dans des échantillons cliniques archivés à l'aide de méthodes basées sur la culture (énumérées dans la note de bas de page du tableau 3). La méthode qPCR « Fluidigm » était capable de classer correctement les sérotypes pneumococciques par rapport à la norme de référence (Quellung) et l'aire de la courbe de l'opérateur du récepteur sous la courbe (ROC-AUC) était supérieure à 0,73 pour tous les ensembles de tests comparés (tableau 3). La qPCR « Fluidigm » a distingué les cibles avec une sensibilité > 80 % (tableau 3) dans les 1 973 échantillons cliniques archivés pour 36 ensembles de tests. La sensibilité diagnostique pour six ensembles de tests (1 ; 7B/C/40 ; 23A ; 29 ; 33B et 35A/C/42) était plus faible (50 à 74 %, tableau 3) car la prévalence des sérotypes ciblés détectés par Quellung était ≤ 1 %, tandis que d'autres sérotypes ciblés ont été détectés à l'aide de la qPCR « Fluidigm » (Fig. 3). Les ensembles de tests restants n'ont pas pu être évalués comme expliqué ci-dessus. La spécificité diagnostique était élevée (> 95 %) pour tous les ensembles de tests où les sérotypes ciblés étaient précédemment détectés par Quellung (tableau 3).

Prévalence des sérotypes individuels de Streptococcus pneumoniae détectés par l'ensemble de réactions qPCR « Fluidigm » par rapport à la méthode Quellung basée sur la culture. Les sérotypes détectés dans les échantillons à la fois par 'Fluidigm' et Quellung sont classés comme concordants, tandis que les échantillons détectés par une seule méthode sont classés comme sérotypes supplémentaires.

Il y avait une bonne concordance entre la culture et la qPCR 'Fluidigm', la majorité des ensembles de tests détectant le même sérotype par les deux méthodes (kappa 0,61–0,8) à l'exception des sérotypes/groupes 1, 5 et 23A qui avaient une bonne concordance (kappa 0,41–0,60) et les sérotypes 7A/F, 11B/C, 12A/F/44, 33A/F, 35A/C/42, 35F et 38 qui présentaient une concordance modérée (kappa 0,21–0,40). Lorsque la concordance était jugée passable ou modérée, cela était dû à la détection de ces sérotypes dans des échantillons supplémentaires par qPCR « Fluidigm » par rapport à Quellung (sérotypes 5 ; 23A ; 12A/F/44 ; 35A/C/42 et 38), et en outre, lorsqu'il y avait moins de cinq échantillons totaux détectés par la méthode Quellung (sérotypes 1 ; 7A/F ; 11B/C ; 33A/F et 35F) (Fig. 3). Pour un ensemble de tests (sérotype 29), la concordance a été jugée médiocre (κ < 0,20). Pour cette cible, la qPCR « Fluidigm » a détecté un échantillon sur deux sérotypé comme 29 en utilisant la méthode Quellung basée sur la culture, cependant, huit autres échantillons qui étaient négatifs en utilisant Quellung, ont été sérotypés comme 29 en utilisant la qPCR « Fluidigm ». La qPCR 'Fluidigm' était plus sensible dans la détection de tous les sérotypes/groupes respectifs par rapport à la culture (test de McNemar : p < 0,05 ; Tableau 3) à l'exception des sérotypes 6C, 7A/F, 7B/C/40, 9L/N, 10A, 11B /C, 15B/C, 18C, 20, 21, 22F, 23B, 25A/F et 33B, où aucune différence de classification n'a été détectée entre les deux méthodes (test de McNemar : p > 0,05 ; Tableau 3). L'ensemble de réactions « Fluidigm » a été en mesure d'identifier 39,1 % (826/2113) de sérotypes supplémentaires au-dessus de ceux détectés par la culture pour les ensembles de tests comparés du tableau 3, et inversement, la culture a détecté 132 (9,3 % de 1419) sérotypes non identifiés par 'Fluidigm' qPCR (Tableau 3, Fig. 3).

La densité moyenne géométrique (GMD) pour tous les sérotypes et cibles bactériennes est présentée dans le tableau supplémentaire S6 et résumée dans la figure supplémentaire S2, et la hiérarchie des sérotypes pneumococciques co-colonisateurs est présentée dans le tableau supplémentaire S7. Parmi les sérotypes supplémentaires détectés par la qPCR « Fluidigm », 72,6 % (831/1 144) étaient des sérotypes co-colonisateurs ou de densité inférieure par rapport au sérotype primaire ou de densité la plus élevée. La GMD des sérotypes supplémentaires détectés par la qPCR « Fluidigm » était inférieure à celle où la désignation du sérotype était concordante entre la qPCR « Fluidigm » et Quellung [2,3 (intervalle de confiance/IC à 95 % : 2,2–2,4) et 4,1 (IC à 95 % : 4,0 –4,2); Fig. 4].

La densité moyenne géométrique (GMD) exprimée en Log10 Gene Equivalents (GE)/mL déterminée par 'Fluidigm' qPCR. Les sérotypes concordants (bleu) ont été détectés à la fois par la méthode Quellung basée sur la culture standard de référence et par « Fluidigm ». Les sérotypes supplémentaires sont ceux qui ont été détectés par qPCR « Fluidigm » uniquement (rouge).

Il y avait un excellent accord entre la densité pneumococcique calculée à partir des ensembles de tests LytA et PiaB (ligne de biais: - 0, 2) par rapport à l'aide des parcelles de Bland – Altman (Fig. S3A supplémentaire). De plus, seulement 6,9 % (58/836) des points de données se situaient en dehors de l'IC étroit à 95 % (− 1,7 à 1,3). L'accord entre la densité pneumococcique moyenne (LytA et PiaB) et la somme de toutes les densités de sérotypes (tous les ensembles de tests spécifiques au sérotype) était acceptable (ligne de biais : - 1,2, Fig. S3B supplémentaire) avec 5,8 % (45/776) des données en dehors de l'IC à 95 % (− 6,7 à 4,0). Dans 7,8 % (65/836) des échantillons positifs pour le pneumocoque, aucun sérotype n'a été détecté, et dans 3,6 % (30/836) supplémentaires, la différence entre la densité pneumococcique et la densité totale des sérotypes était supérieure à l'IC supérieur de l'intervalle Bland– intrigue d'Altman.

Nous avons développé et validé un ensemble de réactions nanofluidiques qPCR qui est sensible, spécifique et reproductible pour la détection et la quantification précises de 92 sérotypes pneumococciques et d'autres bactéries colonisatrices dans 96 échantillons (y compris les calibrateurs) par plaque de réaction. Les performances des ensembles de tests décrits ici sont comparables à d'autres ensembles de réaction-réaction à haut débit pour détecter le portage pneumococcique, y compris dans la plate-forme Standard BioTools 'Fluidigm'32,33 et dans les TaqMan Array Cards15 pour LOD (< 103 UFC/ml) ; efficacité (90–110%); plage dynamique linéaire (quintuple) et linéarité (R2 > 0,98). Notamment, la détection de sérotypes supplémentaires (39,1 %) par le panel qPCR « Fluidigm » décrit ici avec 96 ensembles de tests, est comparable au panel « Fluidigm » décrit précédemment (également 39,1 %), qui comprenait 48 ensembles de tests32. Par rapport à la méthode Quellung basée sur la culture de référence, notre ensemble de réactions était précis à 98,8 % pour la classification des sérotypes pneumococciques. De plus, la sensibilité moyenne sur l'ensemble de réactions qPCR était de 89,1 % par rapport à Quellung.

Les techniques précédentes de sérotypage moléculaire ont détecté des sérotypes communs ; cependant, d'autres TVN émergentes ou rares n'ont pas été détectées. L'élargissement de la gamme de sérotypes détectables par des méthodes à haut débit est devenu de plus en plus important à mesure que la NVT remplace la VT dans le portage41,42,43. Il est également important de détecter et d'attribuer la charge ou la densité bactérienne au portage de plusieurs sérotypes (co-colonisation) directement à partir d'échantillons cliniques sans étape de culture intermédiaire, ce qui est un avantage des techniques moléculaires par rapport aux méthodes standard basées sur la culture44. Auparavant, le sérotypage incomplet a été décrit comme un inconvénient du sérotypage moléculaire dans notre contexte (Afrique du Sud) où la prévalence du sérotype diffère des autres régions géographiques45,46. À notre connaissance, la méthode qPCR « Fluidigm » décrite ici est l'ensemble de réactions de sérotypage moléculaire quantitatif à haut débit le plus complet développé à ce jour.

Notamment, Pai et al.25,26 ont développé une méthode de PCR multiplex conventionnelle pour déterminer 29 sérogroupes/types communs, réduits séquentiellement à 40 sérotypes singuliers. Azzari et al.21 ont utilisé la PCR en temps réel pour détecter 21 sérotypes. Sakai et al.29 ont ensuite conçu 27 nouveaux ensembles de tests pour détecter 72 sérotypes/groupes. Pholwat et al.15 ont optimisé une carte à matrice microfluidique TaqMan (TAC) basée sur la PCR couvrant 74 sérotypes dans jusqu'à sept échantillons cliniques par carte. Sakai et al.30 ont ensuite développé un ensemble de réactions qPCR pour détecter 46 sérotypes individuels et 33 sérotypes au sein de 20 sérogroupes. Dans le 'Fluidigm', Dhoubhadel et al.33 ont utilisé la chimie SYBR Green pour détecter 50 sérotypes (16 sérotypes individuels et 13 sous-groupes). Messoudi et al.31 ont adapté les ensembles de tests de Pai et al.26 dans une PCR multiplex séquentielle en temps réel pour détecter 40 sérotypes ou groupes à l'aide de sondes modifiées par acide nucléique verrouillé (LNA). Ensemble, ces études ont favorisé le développement du sérotypage moléculaire et fourni des ensembles de tests utiles à utiliser dans notre qPCR « Fluidigm » que nous avons encore optimisé dans les pools multiplex STA pour détecter et quantifier 92 sérotypes pneumococciques, en distinguant 16 sérogroupes et 57 sérotypes individuels. Avant notre étude, les sondes modifiées n'ont pas été utilisées dans un système à haut débit tel que les systèmes de PCR micro- ou nano-fluidique ou recommandées dans la plate-forme "Fluidigm" de Standard BioTools. Notre étude a montré que ces stratégies de sondes modifiées fonctionnent bien dans la qPCR nano-fluidique « Fluidigm » à haut débit.

En raison du lien étiologique entre la charge bactérienne élevée, le risque de transmission et le potentiel invasif des sérotypes, la quantification de la charge bactérienne dans les études de portage est importante pour évaluer l'impact du vaccin. Hormis les sérotypes 12F, 8, 24F, 33F, 38 et 10A, il a été démontré que les NVT impliqués dans le remplacement du sérotype de portage ont un faible potentiel invasif selon les analyses des rapports cas-porteurs47,48 ; cependant, des études moléculaires ont montré qu'une densité bactérienne élevée peut prédire le potentiel invasif de ces sérotypes colonisateurs. Parmi les sérotypes supplémentaires contenus dans le PCV15 (22F, 33F) et le PCV20 (8, 10A, 11A, 12F et 15BC), la qPCR « Fluidigm » a identifié 0,3 % supplémentaire de sérotype 8 ; 0,4 % de 10 A ; 1,0 % de 11A/D ; 0,7 % de 12A/F/44 ; 0,9 % de 15B/C et 0,6 % de 33A/F par rapport à la culture. Une étude moléculaire (multi-sites : Afrique du Sud, Brésil, Mali, Cambodge et France) comparant la charge bactérienne nasopharyngée d'isolats invasifs avec des isolats porteurs asymptomatiques pour des sérotypes synonymes, a trouvé une charge bactérienne moyenne cinq fois plus élevée dans les isolats invasifs (263,4 × 105 UFC /ml ; ± 57,07 × 105 contre 49,9 × 105 UFC/ml ± 67,4 × 105)31.

La prévalence bactérienne peut également être intrinsèquement liée à la charge bactérienne qui augmente le risque de transmission ultérieure. Par exemple, la charge bactérienne spécifique au sérotype et la prévalence ont été comparées dans une étude vietnamienne qui comprenait des enfants de moins de 5 ans admis à l'hôpital avec une infection respiratoire aiguë (IRA) et des enfants en bonne santé du même âge. Ici, une charge bactérienne élevée par sérotype était associée à une prévalence plus élevée dans les cas d'IRA (ρ de Spearman = 0,44, n = 186 ; p < 0,0001) et chez les enfants en bonne santé (ρ de Spearman = 0,41, n = 115 ; p < 0,0001).

Notre ensemble de réactions n'incluait pas les ensembles de tests précédemment publiés pour 19F-Atypique, 19C et 23A ; cependant, nous n'avons trouvé aucune indication dans l'analyse in silico que ces ensembles de tests ne détectent pas leurs cibles respectives, et ces ensembles de tests ont bien fonctionné dans d'autres études15,29,30. Le sérotype 23A a toujours été détecté dans notre ensemble de réactions à l'aide d'un algorithme qui combine les résultats de l'ensemble de tests du sérogroupe 23 (23A/B/F) et des ensembles de tests ciblés sur les sérotypes 23B et 23F dans lesquels un échantillon positif pour 23A/ B/F mais négatif pour 23B et 23F serait attribué 23A.

Alors que LytA et PiaB en combinaison sont décrits comme sensibles et spécifiques pour la détection des pneumocoques, et que la densité calculée à l'aide de ces ensembles de tests est concordante, Tavares et al.49 ont depuis recommandé d'utiliser le gène régulateur transcriptionnel putatif SP2020 combiné avec LytA pour une spécificité accrue. Ces quatre ensembles de tests (19F-Atypique, 19C, 23A et SP2020) doivent être davantage validés et inclus dans l'ensemble de réactions pour augmenter la détection à 94 sérotypes, 16 sérogroupes et 59 sérotypes individuels. Les ensembles de tests pour la détection de E. coli, P. jiroveci, S. agalactiae, le gène Xisco de S. pneumoniae et le gène de l'ARN ribosomal bactérien 16S n'ont pas été bien optimisés dans cet ensemble de réactions et ne peuvent donc être utilisés que pour détection qualitative des cibles.

Des défis existent pour distinguer au sein de certains sérogroupes des sérotypes singuliers par notre ensemble de réactions. Ceux-ci comprennent qu'un degré élevé de réactivité croisée entre des sérotypes génétiquement similaires limite la discrimination au niveau du sérotype. Par exemple, les sérotypes 7A/F et 9A/V ne diffèrent génétiquement que par un seul nucléotide dans une région difficile à cibler (faible teneur en GC) avec des séries de paires de bases homogènes qui entraîneraient un mauvais amorçage pour toutes les stratégies à haut débit décrites ici2 . Celles-ci nécessiteront des stratégies plus spécialisées qui ne correspondent pas à notre profil thermique uniforme. En outre, certains sérotypes s'interconvertissent in situ et peuvent ne pas être facilement caractérisés cliniquement en sérotypes distincts, tels que les sérotypes 11A et 11E, 15B et 15C, ou 35B et 35D, qui existent sur un « spectre » en raison d'une perte ou d'un gain incomplet d'acétylation ou transférases50,51. Ces deux derniers sérogroupes, bien qu'ils contiennent des sérotypes moléculairement distincts, ont une distinction clinique problématique et doivent donc être interprétés avec prudence.

D'autres limites à cette étude incluent que notre méthode nécessite un équipement personnel et spécialisé expérimenté (Standard BioTools, 'Fluidigm') qui n'est pas abordable dans de nombreux contextes ; Cependant, cette méthode peut être facilement adaptée à d'autres plates-formes qPCR en temps réel. Lorsque les sérotypes ne sont pas distingués des sérotypes individuels, la charge bactérienne pour les sérotypes détectés au sein des groupes pourrait être surestimée s'il y a co-portage de plus d'un sérotype au sein d'un sérogroupe, par exemple les sérogroupes 12A, 12F et le sérotype 44, ou les sérotypes 7B , 7C et sérotype 40. Comme la colonisation par la plupart de ces sérotypes n'est pas élevée dans notre contexte, cela ne devrait pas avoir un impact très pertinent. La discrimination de ces sérotypes individuellement sera importante dans les contextes où ces sérotypes sont en circulation ou pour évaluer l'émergence de types non vaccinaux dans l'ère post-vaccinale.

La méthode Quellung standard de référence est limitée à la détection des colonisateurs dominants et à plus forte densité, tandis que notre qPCR « Fluidigm » peut détecter plusieurs colonisations simultanées, y compris à plus faible densité. Cela est dû à l'inclusion d'une méthode de sérotypage complète (ensembles de tests couvrant la plupart des sérotypes) et à une sensibilité analytique élevée pour détecter les colonisateurs à faible densité. Ces avantages de la qPCR se traduisent par des comparaisons diagnostiques de ces méthodes sous-estimant la sensibilité diagnostique et la concordance de la qPCR « Fluidigm » par rapport aux méthodes Quellung basées sur la culture, en particulier lorsque la prévalence des sérotypes détectés par la norme de référence est faible. C'était bien le cas pour les sérotypes 1 ; 7B/C/40 ; 23A; 29; 33B et 35A/C/42.

Une autre limitation de la comparaison diagnostique dans notre étude comprend l'utilisation d'échantillons rétrospectifs qui ont subi plusieurs cycles de congélation-décongélation et qui ont été stockés pendant environ 10 ans, ce qui peut affecter la capacité de toute méthode de diagnostic à détecter avec précision les agents pathogènes. La méthode Quellung a été entreprise en 2010 (peu après la collecte des échantillons) et a détecté 9,3 % supplémentaires de sérotypes non détectés par la qPCR « Fluidigm ». En revanche, la sensibilité et la spécificité analytiques de la qPCR « Fluidigm » ont été démontrées dans l'ensemble de la réaction lorsque des calibrateurs de culture ou gBlock nouvellement préparés ont été utilisés. De plus, l'ensemble de réactions qPCR «Fluidigm» pourrait détecter 39,1% de sérotypes supplémentaires qui ont été manqués par Quellung. Ici, la densité (GMD) des sérotypes supplémentaires détectés par 'Fluidigm' qPCR était environ deux fois inférieure à celle des sérotypes détectés de manière concordante par 'Fluidigm' qPCR et Quellung et la plupart (72,6%) étaient des sérotypes sous-dominants qui seraient moins susceptibles être détecté par la méthode Quellung. Néanmoins, notre méthode a pu sérotyper les 1 973 échantillons sélectionnés avec une bonne concordance et sensibilité par rapport à Quellung.

L'utilisation du sérotypage basé sur la qPCR repose sur la détection de courtes séquences cibles dans un locus de synthèse de polysaccharides capsulaires plus large, pour attribuer des sérotypes. La description récente des pneumocoques de type 14-like met en évidence une limitation des identifiants génétiques courts. En Papouasie-Nouvelle-Guinée, quatre isolats de NPS provenant d'enfants hospitalisés atteints d'une infection aiguë des voies respiratoires inférieures se sont vu attribuer le sérotype 14 (une TV invasive) par qPCR. Ces isolats étaient « non typables » (non encapsulés) en utilisant les méthodes Quellung, agglutination au latex et PneumoCaT. Les auteurs décrivent un profil sérologique divergent et la capacité d'échapper à l'immunité induite par le vaccin contre le sérotype capsulaire 14, malgré une similitude génétique partielle. Le séquençage génomique des isolats de type 14 a révélé des mutations qui interrompent les locus biosynthétiques capsulaires, alors que la courte séquence PCR ciblée du sérotype 14 était intacte52. De plus, de petits changements dans les séquences cibles, tels que les polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) ne sont pas facilement discernés à l'aide des méthodes standard de qPCR, alors que ces changements génétiques ponctuels peuvent modifier la structure capsulaire, comme en témoignent les sérotypes 6A et 6B53. L'implication de ces deux exemples est que dans certains cas, le sérotypage moléculaire peut ne pas identifier la diversité antigénique ou de nouveaux sérotypes, et d'autres méthodes de sérotypage doivent être utilisées pour résoudre les divergences.

Dans 7,8 % des échantillons où LytA et PiaB ont été détectés, aucun sérotype n'a été détecté. Dans le cadre de notre méthode, la détection différentielle des pneumocoques et des sérotypes peut indiquer la présence de pneumocoques non typables (NT) ou, moins probable, de sérotypes non inclus dans notre ensemble de réactions. Dans 3,8 % supplémentaires d'échantillons positifs au pneumocoque, la différence de densité de pneumocoques et de densité totale de sérotypes était supérieure à l'intervalle de confiance de la limite supérieure du diagramme de Bland-Altman, ce qui peut être une stratégie utile pour identifier les pneumocoques NT présents dans la co-colonisation avec autres sérotypes. Cette méthode de détection des pneumocoques NT en co-colonisation à l'aide des intervalles de confiance des tracés de Bland-Altman sous-estimerait cependant la NT présente à plus faible densité.

Une limitation de notre méthode implique la détection des régions cibles de sérotype capsulaire qui ont été acquises par des espèces non pneumococciques présentes dans le nasopharynx. Bien que nous ayons inclus que les échantillons doivent être positifs à la fois pour LytA et PiaB, lorsque des homologues de sérotypes non pneumococciques sont présents dans la co-colonisation avec de vrais sérotypes pneumococciques, ceux-ci seraient attribués en tant que sérotypes pneumococciques. Un exemple de ce phénomène est Streptococcus mitis qui exprime une capsule de sérotype 154. Dans les ensembles d'essais cibles où la concordance qPCR avec Quellung a été jugée faible, passable ou modérée à l'aide du kappa de Cohen (sérotypes 1 ; 5 ; 7A/F ; 11B/C ; 12A/F/44 ; 23A ; 11B/C ; 29 ; 33A /F ; 35A/C/42 ; 35F et 38), cela était dû à la détection de ces sérotypes dans des échantillons supplémentaires par qPCR. Lorsqu'ils sont détectés en co-colonisation, nous ne pouvons pas exclure que ces sérotypes supplémentaires détectés soient toujours de vrais pneumocoques. Dans le graphique de Bland-Altman pour l'accord entre la densité moyenne de pneumocoques et la densité de sérotypes, où la densité totale de plusieurs sérotypes colonisateurs simultanés était supérieure à la densité totale de pneumocoques et en dehors de la limite inférieure de l'IC à 95 %, cela peut indiquer la présence de non -homologues de sérotypes pneumococciques. Nous proposons ici que des analyses de séquençage supplémentaires soient entreprises si nécessaire pour la confirmation des sérotypes en co-colonisation, où d'autres streptocoques non pneumococciques sont détectés.

L'un des grands avantages de notre étude est la description des performances par ensemble de tests selon les informations minimales pour la publication des directives quantitatives des expériences de PCR en temps réel (MIQE)55 et la grande taille de l'échantillon d'isolats sérotypés Quellung disponibles pour la validation de notre méthode.

Bien que la configuration de l'ensemble de réactions au sein de la plate-forme qPCR Standard BioTools 'Fluidigm' soit initialement coûteuse, les avantages incluent une grande réduction des coûts de main-d'œuvre et du temps d'attente en raison du nombre élevé de points de données, car de nombreux échantillons sont testés contre de nombreux différents les sérotypes courent dans une plaque. Notre méthode est relativement rapide à exécuter et peut donner des résultats de 92 sérotypes et 15 cibles bactériennes pour 180 échantillons (deux analyses IFC) en une journée. Le coût par échantillon nasopharyngé est d'environ 36 USD, ce qui est très favorable, compte tenu du sérotypage complet et des informations quantitatives générées par échantillon. L'ensemble de réactions concaténées dans la qPCR "Fluidigm" de Standard BioTools sera un avantage dans les grandes études de portage. La méthode doit être validée davantage pour d'autres échantillons cliniques, tels que le sang, les expectorations, le liquide céphalo-rachidien et d'autres sites où le pneumocoque peut être trouvé.

Les ensembles de données générés et/ou analysés au cours de l'étude en cours et les codes Stata sont disponibles auprès des auteurs correspondants sur demande raisonnable.

Bentley, SD et al. Analyse génétique du locus biosynthétique capsulaire des 90 sérotypes pneumococciques. PLoS Genet. 2(3), e31 (2006).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Mavroidi, A. et al. Relation génétique des locus biosynthétiques capsulaires de Streptococcus pneumoniae. J. Bactériol. 189(21), 7841–7855 (2007).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ganaie, F. et al. Un nouveau type de capsule pneumococcique, 10D, est le 100ème sérotype et a un grand fragment cps d'un streptocoque oral. MBio 11(3), e0093720 (2020).

Article Google Scholar

Briles, DE, Crain, MJ, Gray, BM, Forman, C. & Yother, J. Forte association entre le type capsulaire et la virulence chez la souris parmi les isolats humains de Streptococcus pneumoniae. Infecter. Immun. 60(1), 111-116 (1992).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Weinberger, DM et al. Association du sérotype au risque de décès dû à une pneumonie à pneumocoques : une méta-analyse. Clin. Infecter. Dis. 51(6), 692–699 (2010).

Article PubMed Google Scholar

Dagan, R. et al. Réduction du portage nasopharyngé de Streptococcus pneumoniae après administration d'un vaccin conjugué antipneumococcique 9-valent aux tout-petits fréquentant les garderies. J. Infecter. Dis. 185(7), 927–936 (2002).

Article PubMed Google Scholar

Bogaert, D., de Groot, R. & Hermans, PWM Streptococcus pneumoniae colonisation : La clé de la maladie pneumococcique. Lancette infectée. Dis 4(3), 144–154 (2004).

Article CAS PubMed Google Scholar

Whitney, CG et al. Déclin de la pneumococcie invasive après l'introduction du vaccin conjugué protéine-polysaccharide. N. Engl. J. Med. 348(18), 1737–1746 (2003).

Article PubMed Google Scholar

Simell, B. et al. Le lien fondamental entre le portage du pneumocoque et la maladie. Expert Rev. Vaccin. 11(7), 841–855 (2012).

Article CAS Google Scholar

Poehling, KA et al. Maladie pneumococcique invasive chez les nourrissons avant et après l'introduction du vaccin antipneumococcique conjugué. JAMA 295(14), 1668–1674 (2006).

Article CAS PubMed Google Scholar

Platt, HL et al. Un essai de phase II sur l'innocuité, la tolérabilité et l'immunogénicité du V114, un vaccin conjugué contre le pneumocoque 15-valent, par rapport au vaccin conjugué contre le pneumocoque 13-valent chez des nourrissons en bonne santé. Pédiatre Infecter. Dis. J. 39(8), 763–770 (2020).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Hurley, D., Griffin, C., Young, M, Jr., Scott, DA, Pride, MW, Scully, IL, Ginis, J., Severs, J., Jansen, KU et Gruber, WC et al. Innocuité, tolérabilité et immunogénicité d'un vaccin conjugué antipneumococcique 20-valent (PCV20) chez les adultes de 60 à 64 ans. Clin. Infecter. Dis. 1045 (2020).

Weinberger, DM et al. Utilisation des données sur le portage du pneumocoque pour surveiller les changements post-vaccinaux dans les maladies invasives. Am J Epidemiol 178, 1488–1495 (2013).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Habib, M., Porter, BD et Satzke, C. Sérotypage capsulaire de Streptococcus pneumoniae à l'aide de la réaction Quellung. J.Vis. Exp. 84, e51208 (2014).

Google Scholar

Pholwat, S., Sakai, F., Turner, P., Vidal, JE & Houpt, ER Développement d'une carte à matrice TaqMan pour le sérotypage pneumococcique sur des isolats et des échantillons nasopharyngés. J.Clin. Microbiol. 54(7), 1842–1850 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rubin, LG & Rizvi, A. Tests basés sur la PCR pour la détection des sérotypes 3, 14, 19F et 23F de Streptococcus pneumoniae dans les échantillons respiratoires. J. Med. Microbiol. 53(7), 595–602 (2004).

Article CAS PubMed Google Scholar

Brito, DA, Ramirez, M. & de Lencastre, H. Sérotypage de Streptococcus pneumoniae par PCR multiplex. J.Clin. Microbiol. 41(6), 2378–2384 (2003).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lawrence, ER, Griffiths, DB, Martin, SA, George, RC & Hall, LMC Évaluation du test PCR multiplex semi-automatisé pour la détermination des sérotypes et sérogroupes de Streptococcus pneumoniae. J.Clin. Microbiol. 41(2), 601–607 (2003).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

O'Halloran, DM & Cafferkey, MT PCR multiplex pour l'identification de sept sérotypes de Streptococcus pneumoniae ciblés par un vaccin conjugué 7-valent. J.Clin. Microbiol. 43(7), 3487–3490 (2005).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tarrago, D. et al. Identification des sérotypes pneumococciques à partir d'échantillons cliniques négatifs en culture par une nouvelle PCR en temps réel. Clin. Microbiol. Infecter. 14(9), 828–834 (2008).

Article CAS PubMed Google Scholar

Azzari, C. et al. La PCR en temps réel est plus sensible que la PCR multiplex pour le diagnostic et le sérotypage chez les enfants atteints d'une maladie invasive à pneumocoque à culture négative. PLoS ONE 5(2), e9282 (2010).

Article ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Marchese, A. et al. Détection de Streptococcus pneumoniae et identification des sérotypes pneumococciques par réaction en chaîne par polymérase en temps réel à partir d'échantillons de sang d'enfants italiens de ≤ 5 ans atteints de pneumonie communautaire. Microb. Résistance aux médicaments. 17(3), 419–424 (2011).

Article PubMed Google Scholar

Selva, L., del Amo, E., Brotons, P. & Munoz-Almagro, C. Identification rapide et facile des sérotypes capsulaires de Streptococcus pneumoniae en utilisant l'analyse de fragments par électrophorèse capillaire automatisée basée sur la fluorescence. J.Clin. Microbiol. 50(11), 3451–3457 (2012).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

da Gloria, CM et al. Revisiter le portage pneumococcique en utilisant des techniques d'enrichissement en bouillon et de PCR pour une meilleure détection du portage et des sérotypes. J.Clin. Microbiol. 48(5), 1611-1618 (2010).

Article Google Scholar

Pai, R., Limor, J. & Beall, B. Utilisation du pyroséquençage pour différencier les sérotypes 6A et 6B de Streptococcus pneumoniae. J.Clin. Microbiol. 43(9), 4820–4822 (2005).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pai, R., Gertz, RE & Beall, B. Approche PCR multiplex séquentielle pour déterminer les sérotypes capsulaires des isolats de Streptococcus pneumoniae. J.Clin. Microbiol. 44(1), 124–131 (2006).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pimenta, FC et al. Test PCR triplex séquentiel en temps réel pour la détection de 21 sérotypes capsulaires pneumococciques qui représentent une charge de morbidité mondiale élevée. J.Clin. Microbiol. 51(2), 647–652 (2013).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Massire, C. et al. Sérotypage et génotypage simultanés des pneumocoques à l'aide de la PCR et de la spectrométrie de masse à ionisation électrospray. J.Clin. Microbiol. 50(6), 2018-2025 (2012).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sakai, F. et al. Dosages quantitatifs en simple complexe pour la détection et la quantification de la plupart des sérotypes pneumococciques. PLoS ONE 10(3), e0121064 (2015).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Sakai, F., Sonaty, G., Watson, D., Klugman, KP & Vidal, JE Développement et caractérisation d'un ADN synthétique, NUversa, à utiliser comme standard dans les réactions en chaîne par polymérase quantitatives pour le sérotypage moléculaire des pneumocoques. Microbiol FEMS. Lett. 364(17), fnx173 (2017).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Messaoudi, M. et al. La pertinence d'un nouveau test quantitatif pour détecter jusqu'à 40 sérotypes majeurs de Streptococcus pneumoniae directement dans des échantillons cliniques nasopharyngés et sanguins. PLoS ONE 11(3), e0151428 (2016).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Olwagen, CP, Adrian, PV & Madhi, SA Performances du système de qPCR en temps réel Biomark HD (Fluidigm) pour la détection des pathogènes bactériens nasopharyngés et le typage de Streptococcus pneumoniae. Sci. Rep. 9(1), 6494 (2019).

Article ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dhoubhadel, BG et al. Une nouvelle méthode à haut débit pour le sérotypage moléculaire et la quantification spécifique au sérotype de Streptococcus pneumoniae à l'aide d'un système de PCR nanofluidique en temps réel. J. Med. Microbiol. 63(Pt 4), 528–539 (2014).

Article CAS PubMed Google Scholar

Olwagen, CP, Adrian, PV & Madhi, SA Comparaison de la culture traditionnelle et de la qPCR moléculaire pour la détection du portage simultané de plusieurs sérotypes pneumococciques chez les enfants africains. Sci. Rep. 7(1), 4628 (2017).

Article ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Downs, SL, Madhi, SA, Van der Merwe, L., Nunes, MC & Olwagen, CP PCR nanofluidique en temps réel à haut débit pour discriminer les sérogroupes 6, 18 et 22 associés au vaccin antipneumococcique conjugué (PCV) aux sérotypes en utilisant oligonucléotides. Sci. Rep. 11(1), 23728 (2021).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hall, TA BioEdit : un éditeur d'alignement de séquences biologiques convivial et un programme d'analyse pour Windows 95/98/NT. Acides nucléiques Symp. Ser. 41, 95–98 (1999).

CAS Google Scholar

Clustal, W., Thompson, JD, Higgins, DG & Gibson, TJ Amélioration de la sensibilité de l'alignement progressif de séquences multiples grâce à la pondération de séquence, aux pénalités d'écart spécifiques à la position et au choix de la matrice de pondération. Nucleic Acids Res. 22(22), 4673–4680 (1994).

Article Google Scholar

Kibbe, WA OligoCalc : un calculateur en ligne des propriétés des oligonucléotides. Nucleic Acids Res. 35, W43–W46 (2007).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Nzenze, SA et al. Changements temporels de la colonisation par le pneumocoque dans une communauté rurale africaine à forte prévalence du VIH après la vaccination systématique des nourrissons contre le pneumocoque. Pédiatre Infecter. Dis. J. 32(11), 1270-1278 (2013).

Article PubMed Google Scholar

Nzenze SvG, A. et al. Changements temporels de la colonisation pneumococcique chez les couples mère-enfant infectés par le VIH et non infectés par le VIH après la transition du vaccin conjugué antipneumococcique 7-valent au vaccin 13-valent, Soweto, Afrique du Sud. J. Infecter. Dis. 212(7), 1082–1092 (2015).

Article Google Scholar

Heinsbroek, E. et al. Prévalence élevée persistante du portage du pneumocoque chez les adultes infectés par le VIH recevant un traitement antirétroviral au Malawi : une étude de cohorte. SIDA 29(14), 1837 (2015).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kwambana-Adams, B. et al. Le remplacement rapide par des sérotypes pneumococciques non vaccinaux peut atténuer l'impact du vaccin antipneumococcique conjugué sur l'écologie bactérienne nasopharyngée. Sci. Rep. 7(1), 8127 (2017).

Article ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Devine, VT et al. L'ascension et la chute des sérotypes pneumococciques transportés à l'ère du PCV. Vaccin 35(9), 1293–1298 (2017).

Article PubMed Google Scholar

O'Brien, KL & Nohynek, H. Rapport d'un groupe de travail de l'OMS : Méthode standard pour détecter le portage des voies respiratoires supérieures de Streptococcus pneumoniae. Pédiatre Infecter. Dis. J. 22(2), e1-11 (2003).

Article PubMed Google Scholar

Magomani, V. et al. Les défis de l'utilisation du sérotypage moléculaire pour la surveillance des maladies pneumococciques. J.Clin. Microbiol. 52(9), 3271–3276 (2014).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Dubé, FS et al. Comparaison d'une PCR multiplex en temps réel et d'un test de séquençage pour le sérotypage pneumococcique. PLoS ONE 10(9), e0137349 (2015).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Balsells, E. et al. Le potentiel relatif de maladie invasive de Streptococcus pneumoniae chez les enfants après l'introduction du PCV : une revue systématique et une méta-analyse. J. Infecter. 77(5), 368–378 (2018).

Article PubMed Google Scholar

Cohen, R. et al. Potentiel de maladie invasive des sérotypes pneumococciques chez les enfants après la mise en œuvre du PCV13. Clin. Infect Dis. 72, 1453–1456 (2020).

Article Google Scholar

Tavares, DA et al. Identification de Streptococcus pneumoniae par un test PCR en temps réel ciblant SP2020. Sci. Rep. 9(1), 3285 (2019).

Article ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Calix Juan, J. et al. Le spectre des variants pneumococciques du sérotype 11A résulte d'une perte incomplète de l'O-acétylation de la capsule. J.Clin. Microbiol. 52(3), 758–765 (2014).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

van Selm, S., van Cann, LM, Kolkman, MAB, van der Zeijst, BAM et van Putten, JPM Base génétique de la différence structurelle entre les polysaccharides capsulaires de Streptococcus pneumoniae sérotype 15B et 15C. Infecter. Immun. 71(11), 6192–6198 (2003).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Manna, S. et al. Variantes de Streptococcus pneumoniae sérotype 14 de Papouasie-Nouvelle-Guinée susceptibles d'être mal typées et d'échapper à la protection induite par le vaccin. Microbiol. Spectre 10(4), e01524-22 (2022).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Mavroidi, A. et al. Génétique évolutive du locus capsulaire des pneumocoques du sérogroupe 6. J. Bactériol. 186(24), 8181–8192 (2004).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lessa, FC et al. Streptococcus mitis exprimant une capsule pneumococcique de sérotype 1. Savoir représentant 8(1), 17959 (2018).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bustin, SA et al. Les directives MIQE : Informations minimales pour la publication d'expériences PCR quantitatives en temps réel. Clin. Chim. 55(4), 611–622 (2009).

Article CAS PubMed Google Scholar

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Nous tenons à remercier le South African Medical Research Council/Wits Rural Public Health and Health Transitions Research Unit (Agincourt) qui a facilité les prélèvements d'échantillons originaux à Agincourt. De même, nous remercions le personnel des cliniques VIH de l'hôpital universitaire Chris Hani Baragwanath et des cliniques de bien-être pour bébés à Soweto. Nous reconnaissons l'Institut national des maladies transmissibles, Afrique du Sud, où le sérotypage Quellung basé sur la culture a été initialement entrepris. Nous remercions également tous les participants des inscriptions d'Agincourt et de Soweto qui ont fourni des échantillons.

Ce travail a été soutenu par la Fondation Bill et Melinda Gates [Grant No.: OPP1189378]. Il y a eu un soutien partiel du Département des sciences et de la technologie et de la Fondation nationale de la recherche : Initiative de la chaire de recherche sud-africaine sur les maladies évitables par la vaccination ; et le Conseil sud-africain de la recherche médicale. Les bailleurs de fonds n'ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

South African Medical Research Council, Vaccines and Infectious Diseases Analytics Research Unit, School of Pathology, Faculty of Health Sciences, University of the Witwatersrand, Johannesburg, Afrique du Sud

Sarah L. Downs, Shabir. A. Madhi, Lara des Merwe, Martha. C. Nunes et Courtney P. Olwagen

Department of Science and Technology/National Research Foundation, South African Research Chair Initiative in Vaccine Preventable Diseases, Faculty of Health Sciences, University of the Witwatersrand, Johannesburg, Afrique du Sud

Sarah L. Downs, Shabir. A. Madhi, Lara des Merwe, Martha. C. Nunes et Courtney P. Olwagen

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SLD, SAM, MCN et CPO ont conceptualisé et conçu l'étude, et obtenu le financement. SLD était responsable de la conception de l'ensemble de réaction, SLD et CPO étaient responsables de la conception de gBlock. SLD et LvdM ont réalisé les expériences et l'analyse qPCR. SLD a effectué l'analyse statistique. SLD a rédigé le manuscrit initial et tous les auteurs ont révisé, contribué et approuvé le manuscrit final.

Correspondance avec Sarah L. Downs ou Courtney P. Olwagen.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Downs, SL, Madhi, SA, van der Merwe, L. et al. Optimisation d'une PCR nanofluidique en temps réel à haut débit pour détecter et quantifier 15 espèces bactériennes et 92 sérotypes de Streptococcus pneumoniae. Sci Rep 13, 4588 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-31820-4

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Reçu : 02 décembre 2022

Accepté : 17 mars 2023

Publié: 21 mars 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-31820-4

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