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Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 4753 (2022) Citer cet article

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La spectroscopie dans l'infrarouge moyen est une technique sensible et sélective pour sonder des molécules en phase gazeuse ou liquide. L'étude des réactions chimiques dans les applications biomédicales telles que la production de médicaments suscite récemment un intérêt particulier. Cependant, la surveillance des processus dynamiques dans les liquides est généralement limitée aux systèmes volumineux et nécessite donc des analyses hors ligne chronophages. Dans ce travail, nous montrons un capteur à l'échelle de la puce de nouvelle génération, entièrement intégré et robuste pour les mesures en ligne de la dynamique des molécules dans une solution liquide. Notre appareil de la taille d'un doigt utilise la technologie de cascade quantique, combinant l'émetteur, la section de détection et le détecteur sur une seule puce. Cela permet des mesures en temps réel ne sondant que des quantités de microlitres d'analyte dans une configuration in situ. Nous démontrons le fonctionnement du dispositif résolu en temps en analysant les changements conformationnels induits par la température de la protéine modèle albumine sérique bovine dans l'eau lourde. Les mesures quantitatives révèlent d'excellentes caractéristiques de performance en termes de linéarité du capteur, une large couverture des concentrations, allant de 0,075 mg ml-1 à 92 mg ml-1 et une absorbance 55 fois plus élevée que les systèmes de référence encombrants et hors ligne à la pointe de la technologie .

Les capteurs sont entrés dans notre vie quotidienne à d'innombrables niveaux, depuis les diagnostics médicaux1,2,3, la détection environnementale et la recherche climatique4,5 jusqu'à l'imagerie spectrale6 et les applications de sécurité7. Ils détectent, analysent et réagissent à toutes sortes de substances pertinentes, par exemple des produits chimiques potentiellement dangereux8. Alors que la spectroscopie en phase gazeuse dans l'infrarouge moyen (IR moyen) est aujourd'hui bien exploitée pour les applications de détection basées sur la technologie de cascade quantique (QC)9,10,11, les techniques de détection de liquide en sont encore à leurs balbutiements12,13,14. Ils incluent, par exemple, la tentative d'aborder les bandes d'absorption très larges (>10–50 cm−1) dans le milieu de densité beaucoup plus élevée des liquides15,16,17. Cela devient une tâche encore plus difficile, lors de la détection d'analytes cibles à (i) des niveaux de concentration très faibles (ppb à ppt) ou (ii) des concentrations changeant rapidement, tout en étudiant les réactions chimiques ou les changements conformationnels des molécules. Les caractéristiques souhaitables pour les capteurs surveillant les processus dynamiques en phase liquide comprennent des temps de réponse rapides, une sensibilité et une spécificité élevées, ainsi que la capacité d'analyser de larges plages de concentrations dynamiques dans des tailles d'échantillons de l'ordre du microlitre.

Par conséquent, il est très avantageux pour une spécificité de capteur élevée de cibler la région d'empreinte spectrale des absorptions de molécules fondamentales dans la gamme spectrale de l'infrarouge moyen (~ 500–1700 cm-1 18,19), et en particulier la région de la protéine amide Bande I (~1600–1700 cm−1) dans le cas de l'analyse des protéines20.

La sensibilité d'un capteur dépend de ses performances en matière de bruit et de la pente de la ligne d'étalonnage. Dans les techniques spectroscopiques basées sur la loi de Beer-Lambert, la sensibilité peut être adaptée en maximisant la longueur d'interaction effective de la lumière dans l'échantillon. Cependant, les valeurs typiques de longueur d'absorption IR moyen en solution aqueuse se situent à l'échelle micrométrique basse pour les techniques existantes et utilisent souvent des dispositifs volumineux9,14,21. Par conséquent, les sources lumineuses à haute puissance telles que les lasers QC (QCL) et les détecteurs haute performance, comme les détecteurs QC (QCD), sont des outils favorables aux améliorations. Ils permettent d'aborder les applications du monde réel dans la spectroscopie en phase liquide à infrarouge moyen et sont capables de sonder des épaisseurs de film d'échantillon bien au-delà de quelques micromètres, permettant ainsi une manipulation simplifiée et plus robuste des échantillons8,13,22.

Contrairement à la spécificité et la sensibilité du capteur qui étaient déjà abordées par les premières expériences dans la littérature23, nous voulons démontrer un concept qui montre des progrès significatifs sur deux caractéristiques critiques supplémentaires :

(i) Les processus dynamiques, tels que ceux trouvés dans les réactions chimiques24 ou les changements conformationnels, c'est-à-dire les changements structurels de la structure tridimensionnelle des molécules13, révèlent des caractéristiques importantes qui doivent être analysées avec une résolution temporelle élevée pour leur enquête adéquate. Un capteur in situ pour des mesures en temps réel sans étiquette est l'outil idéal pour surveiller ces changements d'analyte, évitant complètement les analyses hors ligne chronophages.

(ii) La capacité d'analyser sur puce des quantités infimes de liquides permet des schémas de détection pour des applications réelles grâce à la miniaturisation des capteurs. Cela inclut les mesures en ligne d'échantillons de microlitres, n'interférant que très peu avec les processus chimiques.

Dans ce travail, nous présentons un capteur mi-IR intégré entièrement monolithique, qui combine toutes les caractéristiques ci-dessus en un seul appareil miniaturisé. Grâce à la combinaison du laser, de la région d'interaction et du détecteur sur une seule puce, et en évitant les limitations de diffraction typiques des systèmes photoniques conventionnels à l'échelle de la puce6,25 en exploitant les guides d'ondes plasmoniques26,27,28, nous réalisons un bout de doigt de la taille (<5 × 5 mm2 ) capteur de liquide rapide de nouvelle génération. Les résultats de simulation confirment la préservation des capacités plasmoniques dans un environnement liquide et permettent l'utilisation de QCLD spectralement optimisés, c'est-à-dire des dispositifs qui émettent et détectent des photons de longueur d'onde similaire29. Nous effectuons deux types de mesures dans notre étude. Nous déterminons la ligne d'étalonnage du capteur et effectuons des expériences de dénaturation thermique, en surveillant le changement connexe de la structure secondaire des protéines, à la fois de l'albumine sérique bovine (BSA) 12,13,30,31,32,33 dans une matrice D2O. Étant donné que notre travail comprend une analyse des performances du capteur à l'aide de simulations optiques par éléments finis (FEM) avec le logiciel commercial COMSOL, nous pouvons également confirmer théoriquement son excellente aptitude à un fonctionnement in situ dans une matrice liquide. Nous déterminons ensuite les chiffres de mérite analytiques importants sur le plan expérimental, notamment : (1) LOD, (2) la linéarité du capteur avec la concentration de l'analyte, (3) la plage de concentration accessible et le volume d'échantillon de notre capteur, et (4) la robustesse contre les exposition à l'analyte. Nous complétons notre étude en démontrant le fonctionnement de notre capteur QCLD lorsqu'il est immergé dans de l'eau normale (H2O), en tant que matrice biophysiquement native et la plus pertinente. En conséquence directe de l'intensité entièrement absorbée du mode optique dans l'eau, en raison de la grande profondeur de pénétration effective du capteur, nous pouvons utiliser simultanément le signal de détecteur mesuré restant de cette expérience pour la correction de la diaphonie électrique.

Notre objectif est de caractériser avec précision notre capteur QCLD et d'extraire ses chiffres de mérite pertinents, ainsi que de démontrer sa capacité à surveiller les changements dans la structure secondaire des protéines en temps réel. Pour ces expériences, nous utilisons la BSA comme protéine monomère soluble dans l'eau (voir Fig. 1a et Supplément A). La BSA est fréquemment utilisée dans les études biophysiques fondamentales, telles que l'étude de la dénaturation thermique30,34,35 qui entraîne des modifications de l'absorption IR moyen dans la région amide I des protéines. Des enquêtes sur la dénaturation thermique de la BSA étaient auparavant régulièrement effectuées à la fois dans H2O et D2O30,31,32,34,35, fournissant un riche ensemble de données, en particulier pour les expériences dans l'eau lourde.

a Mesure de référence du spectromètre infrarouge à transformée de Fourier à réflexion totale atténuée (ATR-FTIR) du processus de dénaturation thermique de la BSA, analysée dans la gamme de la bande amide I\(^{\prime}\) entre 50 ∘C (bleu) et 90 ∘C (rouge). La transition induite par la température de l'hélice α (1651 cm-1, bleu) à la feuille β (1615 cm-1, rouge) est indiquée. b Concept de capteur sur puce incluant le mode plasmonique indiqué. L'émetteur (QCL, 10 μm de large) et le détecteur (QCD, 15 μm de large) sont connectés via un guide d'ondes plasmonique à base de SiN conique de 48 μm de long. L'ensemble du capteur est immergé dans la solution d'échantillon (D2O + BSA), qui est indiquée par la couche transparente bleue sur la puce. La couche d'or (guide d'onde plasmonique et contacts électriques) est indiquée en couleur or, la passivation SiN et la couche de charge diélectrique sont indiquées en marron et le substrat InP est indiqué en gris foncé.

L'eau lourde est souvent utilisée pour l'analyse des protéines afin d'éviter le chevauchement de la bande de flexion HOH de l'eau avec la région amide I de la protéine dans la spectroscopie IR moyen. Cela crée une fenêtre spectrale ouverte dans cette gamme avec une absorption réduite, permettant de plus grandes longueurs d'interaction12,30,31,32,35,36,37,38,39,40,41,42. En règle générale, l'eau lourde peut fournir certains écarts par rapport aux conditions biophysiques entièrement natives. Il a été constaté que l'exposition des protéines au D2O peut influencer la longueur et la force des liaisons hydrogène et peut entraîner des changements dans la dynamique des protéines43 ainsi que la dénaturation des protéines44. Mais ces propriétés différentes du D2O peuvent également être exploitées dans l'analyse d'échantillons biologiques spécifiques, par exemple pour ralentir considérablement les interactions protéine-solvant dans les cellules vivantes pour des expériences in vitro45.

Pour l'expérience rapportée ici sur la dénaturation thermique de la BSA, il a été constaté que les transitions structurelles de la BSA étaient similaires dans H2O et D2O, avec la seule différence d'une température de transition inférieure dans l'eau lourde32. Travailler en D2O nous permet ainsi d'enregistrer des données avec un rapport signal sur bruit élevé et d'exploiter tout le potentiel de notre concept de capteur dans le suivi dynamique des réactions. Cela permet également de mieux exploiter le concept de détection plasmonique, qui permet la propagation en mode optique sur des échelles de longueur de dizaines à centaines de micromètres. Notre capteur sur puce présente une longueur d'interaction d'échantillon d'environ 48 μm, ce qui facilite l'analyse de la BSA dans du D2O sur une large plage de concentration, couvrant plus de trois ordres de grandeur, de ~75 μg ml−1 à >92 mg ml− 1. En revanche, l'utilisation d'un tampon H2O hautement absorbant limite généralement les longueurs de trajet à un maximum de 10 μm dans le cas d'expériences basées sur FTIR à faible intensité46 et à ~ 25 μm47 lors de mesures de transmission basées sur QCL à haute intensité, avec la conséquence d'un limite de détection (LOD) considérablement réduite.

La technologie de cascade quantique héberge des outils très puissants et polyvalents pour la spectroscopie IR moyen en phase gazeuse et liquide2,14,26,48,49,50. La possibilité d'utiliser un QCL non biaisé en tant que photodétecteur haute performance51,52,53, a permis la réalisation de QCL et QCD intégrés monolithiques, notés comme un dispositif QCLD29. Il présente un excellent chevauchement spectral entre le laser et le détecteur29. Dans ce travail, nous débloquons tout le potentiel du concept QCLD pour les applications optiques de laboratoire sur puce, adaptées à l'analyse des protéines dans la gamme spectrale de la bande amide I\(^{\prime}\)13,14,32 ,35.

Le QCLD utilisé dans ce travail est basé sur une conception de région active (AR) liée au continuum, optimisée pour la même longueur d'onde d'émission et de détection. Pour cibler la bande spectrale amide I\(^{\prime}\), hébergeant la gamme d'absorption de BSA dans D2O32,35, il est conçu pour fonctionner autour de 6,5 μm de longueur d'onde. En particulier, l'AR est construit à partir de puits quantiques / barrières In0.53Ga0.47As / In0.52Al0.48As dans un total de 37 cascades, qui sont développées en treillis adapté au substrat n-InP par épitaxie par jet moléculaire (MBE) et pris en sandwich dans une structure de guide d'ondes. Pour sélectionner des modes d'émission spectraux individuels qui ciblent des plages de longueurs d'onde étroites dans les larges caractéristiques d'absorption de l'analyte d'environ 20 à 40 cm-1, un réseau à rétroaction distribuée (DFB)54,55,56 est mis en œuvre dans la gaine supérieure de la structure de guide d'ondes QCL57 ,58 (détails sur AR26 : et réseau DFB : Supplément B). Comme le montrent Ristanić et al.27, cela conduit à des largeurs de raie à l'échelle ~MHz et en dessous56 et améliore les fluctuations de bruit et d'émission dans les lasers pulsés59,60.

Nous utilisons des guides d'ondes de crête Fabry-Pérot (FP) standard pour le laser (~ 2,5 mm de long) et le détecteur (~ 200 μm de long), séparés par un guide d'ondes à polariton de plasmon de surface chargé diélectrique (DLSPP) de ~ 48 μm (200 nm- dalle épaisse de SiN au-dessus d'une couche inférieure d'Au de 60 nm d'épaisseur, voir Fig. 1b). Ce dernier est effilé de 10 μm de large au QCL à 15 μm au QCD. En raison de la faible conductivité électrique de l'analyte, nous pouvons immerger directement notre capteur dans le liquide sans revêtements protecteurs supplémentaires. Nous avons encore augmenté la sensibilité du capteur QCLD en s'attaquant aux principales sources de bruit des dispositifs techniques de fluctuations de température61,62 et de diaphonie électrique connues pour compacter les géométries sur puce17,63. Le premier a été traité par des mesures de température sur puce et le second par des contacts électriques avec une séparation accrue et une correction de diaphonie post-expérience. Les caractéristiques spectrales détaillées d'émission et de détection du QCLD sont présentées dans la Fig. 1 supplémentaire.

Les performances spectrales d'un guide d'onde plasmonique sont dominées par ses caractéristiques structurelles et matérielles (indice de réfraction complexe n) à la longueur d'onde cible λ, y compris le milieu hôte environnant. Il a été montré que pour les guides d'ondes DLSPP minces, une partie remarquable de> 96% du mode est guidée à l'extérieur du guide d'ondes (épaisseur DLSPP ≪ longueur d'onde), pénétrant son milieu diélectrique environnant, comme, par exemple, l'air26. Cela rend ces guides d'ondes parfaitement adaptés à la spectroscopie liquide, car leurs propriétés de propagation sont sensibles à leur milieu environnant.

Pour analyser notre guide d'ondes DLSPP à base de SiN lorsqu'il est exposé à D2O et BSA dans D2O, nous simulons la propagation du mode plasmonique à l'aide du solveur de mode propre du logiciel commercial COMSOL basé sur FEM (v.5.5). Nous nous concentrons sur les deux longueurs d'onde d'intérêt : 6,26 μm (1597 cm-1, série de concentration) et 6,17 μm (1620 cm-1, expérience de dénaturation BSA). La figure 2a montre le profil de mode transverse dans l'air à 6,17 μm avec nSiN = 1,79.

a La section efficace de mode du guide d'onde SiN sur Au DLSPP (nSiN = 1,79, dimensions en médaillon : dAu : épaisseur d'or, dSiN : épaisseur de SiN et wSiN : largeur de la dalle de SiN), b Simulation de vue de dessus 2D le long du guide d'onde conique DLSPP de 48 μm entre QCL et QCD dans l'air (gauche) et D2O (droite) ainsi que le profil de la section longitudinale le long du guide d'onde DLSPP 48 μm réalisé dans : c air et d D2O. La ligne blanche en a, c et d représente la couche plasmonique Au.

L'indice de réfraction nSiN est obtenu à partir des mesures de l'ellipsomètre IR moyen illustrées à la Fig. 2 supplémentaire, indiquant des résultats similaires à ceux de la littérature64. Les valeurs obtenues aux deux longueurs d'onde, c'est-à-dire 1597 cm−1 et 1620 cm−1, pour la longueur de propagation Lp (distance 1/e-decay en μm), l'indice effectif de mode neff et les pertes (en dB mm−1 et dB par 48 μm = section plasmonique entre QCL et QCD) sont présentés dans le tableau 1. La longueur de propagation est inférieure de 7 % à une longueur d'onde plus courte, une conséquence de la géométrie du guide d'onde plasmonique légèrement plus appropriée pour les longueurs d'onde plus longues28. Pourtant, Lp est ≥1,7 mm, ce qui correspond à des pertes inférieures à 0,13 dB pour une section de guide d'ondes de 48 μm, confirmant les caractéristiques de faible perte de nos guides d'ondes DLSPP dans l'air. Le profil de mode et le neff ne montrent que des différences négligeables aux deux longueurs d'onde.

Dans ce qui suit, nous comparons les profils de mode longitudinal de 6,17 μm dans l'air au cas du D2O comme milieu environnant. Comme le montre la Fig. 2, le mode est très bien confiné dans l'air (voir Fig. 2b, c), et on observe un couplage laser-guide similaire dans D2O (voir Fig. 2d, réf. 40). C'est un résultat remarquable, car l'indice de réfraction de l'air (nair ≈ 1) est nettement inférieur à celui du D2O de \({n}_{{{{{{{\rm{D}}}}}}}_ {2}{{{{{\rm{O}}}}}}\) = 1,340. Pourtant, le mode reste très bien confiné et guidé du laser au détecteur, montrant l'excellente adéquation du guide d'onde DLSPP pour la spectroscopie liquide. L'ajout de BSA au D2O n'a qu'un effet négligeable sur l'indice de réfraction (par exemple, Δn ~ 10−4 pour 0,25–2% m v−140) par rapport à l'oxyde de deutérium pur.

Enfin, nous avons étudié l'influence du D2O sur le mode plasmonique par des simulations 2D en vue de dessus du guide d'onde conique DLSPP, affichant une coupe horizontale à 60 nm au-dessus de la couche de SiN. Comme le montre la figure 2b, il n'y a que des différences mineures lors de la comparaison de l'air (à gauche) avec du D2O (à droite), donc également une réduction minimale du confinement en mode latéral.

Une façon courante de mesurer l'absorbance des liquides dans la gamme spectrale IR moyen est basée sur la spectroscopie à réflexion totale atténuée (ATR)65. Dans cette technique, l'échantillon est placé sur la surface d'un élément ATR optiquement dense. La lumière infrarouge incidente sous un certain angle est réfléchie à l'interface vers l'échantillon, le pénétrant au minimum avec son champ évanescent.

Dans une telle configuration, l'absorbance A d'un liquide avec l'épaisseur de couche effective deff peut être obtenue en utilisant la loi de Beer-Lambert9,66 : A = deff ⋅ e ⋅ c, avec le coefficient d'absorption décadique molaire e et la concentration de l'analyte c. Une courbe expérimentale A vs c montre donc une dépendance linéaire65,66 avec la pente donnée par le produit deff ⋅ e.

La longueur de trajet effective de notre capteur QCLD a été déterminée en comparant son absorbance à celle des mesures de référence de l'interféromètre infrarouge à transformée de Fourier à réflexion totale atténuée à réflexion unique (ATR-FTIR). Pour l'accessoire ATR on obtient : deff = 0,838 μm à 1597 cm−1, déterminé dans H2O (e = 10,9 L mol−1 cm−1)67.

Nous avons calibré les performances de notre capteur QCLD à travers une série de concentrations de BSA dans D2O, obtenant sa courbe A vs c. Nous le comparons aux résultats d'autres techniques de mesure de pointe actuelles, y compris le dichroïsme circulaire (CD) et la spectroscopie FTIR13, ainsi que les capteurs basés sur ATR9, y compris, par exemple, la spectroscopie ATR-FTIR basée sur fibre12. De plus, nous extrayons des valeurs de performance importantes du capteur telles que le LOD et la longueur de trajet effective dans l'analyte sondé deff. Cela contraste avec les études précédentes, qui effectuaient principalement une analyse qualitative34,35,40,68.

La figure 3 montre la configuration de mesure de la concentration. Il comprend une solution mère d'environ 50 ml de BSA dans du D2O à une concentration fixe de 150 mg ml-1. À l'aide d'une pompe péristaltique (Ismatec Reglo ICC, 3 canaux, 8 rouleaux), nous ajoutons en continu 1 ml de la solution mère dans un second bécher rempli de 30 ml de D2O pur (99,9 % atomique D). Le capteur QCLD est directement immergé dans le bécher D2O montrant sa robustesse vis-à-vis d'une exposition directe à la solution contenant des protéines. Pour cette expérience nous polarisons QCL 1 émettant à 1597 cm−1, mesurons le signal de son QCD 1 correspondant et l'analysons avec un oscilloscope 350 MHz (Teledyne LeCroy HDO4034 2.5 GSPS). En parallèle, nous surveillons la température du liquide avec deux sondes de température précédemment caractérisées : (i) nous polarisons le QCL 2 voisin à 0,5 mA et surveillons sa variation de résistance induite par la température à l'aide d'un sourcemètre (série Keithley 2400), comme un sonde de température à puce et (ii) nous plongeons en outre une sonde de température (Pt100) dans le liquide.

Une pompe péristaltique pompe en continu la solution mère (50 ml de BSA dans du D2O à 150 mg ml-1) vers le bécher de mesure, initialement rempli de D2O pur. Le capteur QCLD est directement immergé dans ce deuxième bécher pour surveiller les changements de concentration.

La figure 4 montre les courbes A vs c résultantes à 1597 cm-1 et à température ambiante mesurées en unités d'absorbance (AU) avec notre capteur QCLD (carrés bleus) et le capteur de référence ATR-FTIR (cercles violets). L'absorbance est obtenue en normalisant le signal BSA à sa ligne de base D2O uniquement mesurée précédemment et en prenant le logarithme décadique de cette valeur. Comme attendu pour un capteur suivant la loi de Beer-Lambert, on obtient une droite de calibration linéaire66. Nous voulons souligner notre capacité à sonder 48 μm de solution pour une large gamme de concentrations de BSA allant de <100 μg ml-1 à > 92 mg ml-1. En revanche, de telles expériences étaient jusqu'à présent généralement réalisées avec des systèmes ATR-FTIR grands et volumineux31,34.

Résultats en unités d'absorbance (AU) du capteur QCLD pour BSA dans D2O avec (étoiles rouges) et sans (carrés bleus) correction de diaphonie de 18 mV (échelle de gauche) et par rapport au système ATR-FTIR à simple réflexion (cercles violets , échelle de droite). L'échelle de droite est divisée par un facteur de 10 par rapport à celle de gauche pour une meilleure visibilité du signal ATR-FTIR.

Les spectres ATR de la Fig. 1a révèlent que l'absorbance A = 0,00118 AU (unités d'absorbance) de BSA est assez faible à 1597 cm-1 dans une solution de 20 mg ml-1 de BSA, ce qui permet de sonder des concentrations plus élevées. En revanche, il est préférable de mesurer à haute absorbance, pour analyser la plage de faible concentration. Comme le montre la figure 4 pour 85 mg ml-1 et plus, nous pouvons observer des écarts par rapport à la courbe linéaire. Ils résultent d'un faible signal QCD pour augmenter les concentrations de BSA. Nous pouvons conclure que les concentrations maximales que nous pouvons mesurer avec le capteur sont attendues dans la plage de 92 mg ml−1 à 1597 cm−1.

Une comparaison directe avec la mesure ATR montre que notre capteur sur puce produit une absorbance 39 fois plus élevée, surpassant clairement le système ATR-FTIR de pointe. De plus, la possibilité d'immerger notre capteur directement dans le liquide sans mesures de protection supplémentaires est un avantage évident de notre approche in situ et permet une surveillance en ligne en temps réel des réactions chimiques dans les systèmes chimiques avancés. Cela contraste fortement avec les techniques analytiques typiques de pointe, y compris la spectroscopie ATR-FTIR, qui sont soit limitées à des mesures hors ligne, soit à des mesures en ligne, par exemple, en fusionnant une cellule fluidique avec le cristal ATR69 en des mesures encore plus complexes. et des systèmes encombrants.

Alors que la compacité de l'approche basée sur QCLD conduit aux avantages clairs du capteur discutés précédemment, nous observons la diaphonie électrique comme un inconvénient de l'intégration à faible encombrement (généralement : <25 mm2). Cet effet parasite peut être quantifié en effectuant des mesures dans H2O déionisé (DI) entièrement absorbant et en corrigeant les mesures BSA pour la diaphonie électrique obtenue. Le résultat est représenté sur la figure 4 sous forme d'étoiles rouges et donne des valeurs d'absorbance même 55 fois plus élevées que la configuration ATR-FTIR. Cela peut être utilisé pour estimer la profondeur de pénétration effective deff,QCLD par : 55 × deff,ATR = 46,09 μm = deff,QCLD (avec deff,ATR = 0,838 μm) et correspond très bien à la longueur réelle de 48 μm si l'on considère que 96% du mode est guidé à l'extérieur du guide d'ondes.

Pour une analyse quantitative plus approfondie, nous pouvons également calculer cette valeur en utilisant les données expérimentales A-vs-c de la Fig. 4 en combinaison avec la formule déjà introduite pour la loi de Beer-Lambert et le deff, ATR précédemment obtenu = 0,838 μm. Le résultat est donné dans le tableau 2. La valeur obtenue de deff,QCLD = 43,1 μm est à nouveau en bon accord avec la longueur réelle du guide d'onde plasmonique de 48 μm.

Comme autre facteur de mérite important dans la détection chimique, nous avons déterminé le LOD de notre capteur QCLD par rapport à la configuration ATR-FTIR comme indiqué dans le supplément E. Afin d'évaluer le LOD du capteur sur puce pour un temps rapide échelles, nous avons calculé l'écart type std (t) pour plusieurs intervalles de temps longs d'environ 11 s mesurés pour une BSA de 20 mg ml-1 dans une solution de D2O et avons déterminé la LOD correspondante = 0,092 mV (voir le tableau 3, pente de la Fig. 3) : cela correspond au changement de concentration minimum détectable de BSA en mg ml-1 en utilisant la ligne d'étalonnage mesurée dans la plage de faible concentration de 0 à 25 mg ml-1. Il en résulte une concentration minimale en BSA récupérable de : LOD (mg ml−1) = 75 μg ml−1 ⇒ LOD(ppm) = 75 ppm en poids et une couverture de plus de trois ordres de (BSA-)concentrations, entre 75 µg ml-1 et 92 mg ml-1. Il convient de noter que notre capteur immergé n'est stabilisé en température que par la stabilité de température du liquide, tandis que la mesure de température sur puce n'a été utilisée qu'à des fins de surveillance, sans l'utiliser pour des mesures de stabilisation. A titre de comparaison, le tableau 3 montre le LOD de la configuration ATR. Alors que l'avantage évident de la technique ATR basée sur FTIR réside dans l'enregistrement d'un spectre IR complet (400–4000 cm−1) dans le temps de mesure de 11 s, c'est un résultat remarquable que notre capteur sur puce ait un LOD 120 fois plus faible. L'inconvénient d'adresser une seule longueur d'onde avec notre capteur basé sur QCLD peut être considérablement atténué par la mise en œuvre simple de concepts de réseau basés sur QC17,70.

D'autres approches de détection de protéines rapportées dans la littérature, en particulier celles basées sur SEIRAS (Surface Enhanced IR Absorption Spectroscopy) combinées à des techniques ATR traditionnelles, donnent des LOD encore meilleures que notre QCLD (facteur de ~ 2,1 à ~ 18,1). Mais ils reposent sur des schémas plus complexes, par exemple en ajoutant différents types de nanoparticules Au71,72. Cela contraste avec la surface non encore fonctionnalisée de notre capteur QCLD, qui fait partie des travaux futurs73,74.

Dans la figure 5, nous présentons la configuration de l'expérience de dénaturation thermique de BSA. Dans cette expérience, nous utilisons une cellule d'écoulement à l'échelle du microlitre de 60 μl sur mesure. La routine de mesure étape par étape est décrite dans la section "Méthodes".

Nous utilisons une cellule de 60 pi sur mesure pour cette expérience. La solution mère (35 ml de BSA dans du D2O à 20, 40 et 60 mg ml−1) est constamment chauffée de la température ambiante à 90 ∘C, tout en étant continuellement pompée à travers un bécher avec un liquide de refroidissement à 20 ∘C et dans la cellule contenant le capteur QCLD. Après une mesure (continue), il est pompé et éliminé.

Pour surveiller le processus de dénaturation thermique31, nous avons utilisé un capteur QCLD adressant une longueur d'onde de 1620 cm-1. La figure 6 montre les résultats obtenus. Les valeurs absolues en unités d'absorbance (AU) sur la figure 6a incluent la correction de la diaphonie, comme déjà discuté pour la série de concentration. Pour obtenir la valeur de correction de diaphonie, nous utilisons le rapport d'absorbance attendu aux deux longueurs d'onde : A(1620 cm-1) par A(1597 cm-1). Nous extrayons une diaphonie de 6 mV, ce qui est en très bon accord avec notre analyse de capteur à 1620 cm-1, révélant que nous pouvons mesurer des courbes de dénaturation raisonnables à des niveaux de signal d'environ 10 mV.

Etude de trois concentrations différentes de BSA : 20 (rouge), 40 (bleu) et 60 mg ml-1 (violet) et extraction de la température de transition x0. a Valeurs de mesure absolues (cercles) et courbes sigmoïdales de Boltzmann-Fit (traits pleins) en unités d'absorbance (AU). b Comparaison des courbes d'ajustement de Boltzmann (normalisées individuellement), montrant la dépendance à la température et à la concentration des courbes d'absorbance de forme sigmoïdale.

La figure 6a représente le signal d'absorbance pour différentes températures entre 45 ∘C et ~90 ∘C pour les trois concentrations 20 mg ml−1 (rouge), 40 mg ml−1 (bleu) et 60 mg ml−1 (violet) à 1620 cm-1. Nous pouvons observer la forme sigmoïdale attendue du processus de dépliement des protéines13 pour les trois concentrations étudiées, confirmant les découvertes précédentes de la littérature34. Un avantage supplémentaire de notre expérience en ligne réside dans sa très faible consommation de liquide (débit de la pompe : ~17 μl s-1, volume de cellule microfluidique : ~60 μl).

Pour une évaluation quantitative des mesures et une comparaison avec la littérature, la figure 6b affiche la progression des courbes d'absorbance normalisées pour les trois concentrations de BSA. Les lignes pleines montrent les courbes d'équation de Boltzmann sigmoïdales correspondantes de l'ajustement aux données de la Fig. 6a définies comme : y = A2 + (A1−A2) ⋅ (1 + \({e}^{{(x-x0)dx} ^{-1}}\))−1 avec les valeurs d'absorbance initiale et finale A1 et A2, respectivement, la température de transition x0 telle que définie par la valeur x0 qui correspond à y0 = (A1 + A2) ⋅ 2−1 et la pente dx. Ils suivent la même forme en s que celle observée dans d'autres expériences de la littérature avec BSA31 ainsi que d'autres protéines13, y compris la diminution des températures de transition x0 avec l'augmentation de la concentration en BSA (voir aussi Schwaighofer et al. pour, par exemple, la protéine poly-l-lysine13) .

Un tel comportement s'est avéré être une fonction de la vitesse de chauffage au cours du processus de dénaturation. Nous avons donc analysé le chauffage correspondant pour les trois concentrations, confirmant des taux de chauffage presque identiques, comme indiqué dans la Fig. 4 supplémentaire.

La matrice D2O fournit des conditions très similaires pour observer le processus de dénaturation de la BSA induite par la température par rapport aux conditions biophysiques entièrement natives dans H2O. Nous avons donc soigneusement sélectionné cette expérience, puisque les différences avec H2O ne sont qu'une légère augmentation de la température de transition pour la dénaturation de la BSA32. Néanmoins, nous voulons démontrer la pleine capacité de notre dispositif monolithique à fonctionner dans une matrice protéique réelle et nous avons donc mené une expérience de submersion supplémentaire dans H2O pur. Comme le montre la figure 7, nous avons immergé l'ensemble du capteur dans l'eau sous polarisation opérationnelle avec des conditions de conduite similaires à celles de D2O, pendant environ une minute, et avons surveillé le signal du détecteur. Comme H2O absorbe toute l'intensité du mode optique, le signal de détecteur restant résulte de la diaphonie sur puce, en raison de la nature compacte de l'appareil et pourrait être utilisé pour la correction de la diaphonie. Une indication du bon fonctionnement du capteur en solution aqueuse peut être vue par le léger changement de température d'environ 0,09 ∘C au cours de l'immersion d'une minute, et la petite augmentation simultanée du signal du détecteur (~0,2 mV), suite à un changement similaire. comportement comme dans une solution deutérée. Nous tenons à souligner que cette expérience a été réalisée entre deux mesures de dénaturation, et nous n'avons observé aucun impact ou effet négatif sur le fonctionnement du capteur lors de la comparaison des performances avant et après l'immersion dans l'eau.

Signal du détecteur lors du fonctionnement du capteur QCLD dans DI-H2O pendant environ 1 min et en augmentant la température d'environ 0,1 ∘C.

Dans l'étape suivante, la réalisation d'un capteur QCLD sur puce pour des expériences de surveillance de réaction similaires, comme précédemment effectuées dans D2O, mais fonctionnant dans une matrice hautement absorbante comme l'eau, nécessite une géométrie de dispositif repensée. Des longueurs d'interaction plasmonique beaucoup plus courtes, généralement de l'ordre de 10 à 15 μm, sont nécessaires dans un tel cas et font partie de nos travaux futurs. La démonstration fondamentale présentée du fonctionnement d'un dispositif monolithique dans l'eau ouvre la porte à l'utilisation de capteurs QCLD similaires, ouvrant ainsi tout le domaine de la surveillance de la réaction IR moyen sur puce d'échantillons biochimiques et pharmaceutiques.

En conclusion, nous montrons une nouvelle génération de laboratoire sur puce infrarouge moyen de la taille d'un doigt, adapté à l'analyse sensible et sélective in situ en temps réel des réactions chimiques dans les liquides.

Nous avons analysé le processus de dénaturation de la protéine BSA dans une matrice D2O avec notre capteur, qui fonctionne aux longueurs d'onde de 1597 cm-1 et 1620 cm-1. Le QCLD est basé sur l'intégration monolithique d'un QCL, d'un guide d'onde DLSPP et d'un QCD sur une seule puce miniaturisée. Il permet des mesures in situ et en ligne en temps réel, ne sondant dans ce dernier cas que des microlitres de liquide. Sa haute performance est démontrée par une très faible LOD de 75 ppm en poids (=0,0075% m v-1) et il suit la loi de Beer-Lambert jusqu'à 9,23% m v-1 de concentration en BSA. Ceci est confirmé par une mesure de ligne d'étalonnage sur toute la plage de concentration couvrant plus de trois ordres de grandeur. Dans une mesure de dénaturation des protéines, nous révélons l'augmentation typique de l'absorbance en forme de s sigmoïde avec l'augmentation de la température de traitement BSA, ainsi qu'une température de transition dépendante de la concentration. Ce dernier a pu être mis en évidence en effectuant des mesures de dénaturation dynamique à des concentrations de 20, 40 et 60 mg ml-1.

De plus, le comportement du capteur QCLD, lorsqu'il est immergé dans un liquide comme le BSA dans D2O, a été modélisé par des simulations basées sur FEM (COMSOL) de la section d'interaction plasmonique incluant l'analyte. Ils montrent l'excellente adéquation de ce type de capteur monolithique et de matériaux pour la détection dans une matrice D2O et pour l'observation des processus de dénaturation thermique dans une large gamme de concentrations de BSA. Ceci présente une démonstration appropriée d'une surveillance de réaction dynamique sur puce en temps réel.

Après l'analyse détaillée de notre capteur dans ce travail utilisant une matrice D2O, incluant une première démonstration du fonctionnement de l'appareil dans des conditions protéiques réelles utilisant une matrice eau, la prochaine étape sera une étude complète des processus dynamiques dans des conditions biophysiques dans H2O. Cela nécessitera la géométrie de guide d'ondes plasmonique repensée et optimisée, ainsi qu'une sélection rigoureuse de la ou des longueurs d'onde de mesure pour éviter les pics d'absorption les plus élevés dans l'eau. Avec les résultats des travaux en cours, y compris les résultats des simulations effectuées, une telle conception optimisée peut maintenant être mise en œuvre directement.

Les mesures d'absorption FTIR de la BSA ont été effectuées à l'aide d'un spectromètre FTIR Bruker Tensor 37 (Ettlingen, Allemagne) équipé d'un module Bruker Optics Platinum ATR (cristal de diamant, 1 mm2 avec simple réflexion) et d'un DLaTGS (deuterated lanthanum a-alanine doped triglycine sulfate) détecteur (D* = 6 × 108 cm \(\sqrt{{{{{{{\rm{Hz}}}}}}}}}\) W−1 à 9,2 μm). Pendant les mesures, le spectromètre a été constamment rincé avec de l'air sec pendant au moins 10 min avant l'acquisition des données jusqu'à ce que l'absorption de vapeur d'eau soit suffisamment constante. Les spectres ont été acquis avec une résolution de 4 cm-1 en mode d'acquisition double face ; la vitesse du miroir a été fixée à 20 kHz. Un total de 26 balayages (temps de mesure : 60 s) ont été moyennés par spectre, ce qui a été calculé à l'aide d'une fonction d'apodisation à 3 termes de Blackman-Harris et d'un facteur de remplissage zéro de 2. Tous les spectres ont été acquis à 25 °C. Les spectres ATR-FTIR enregistrés ont été traités avec une correction ATR avancée et analysés à l'aide du progiciel OPUS 8.1 (Bruker, Ettlingen, Allemagne). Pour les mesures quantitatives, 30 μl de solution de BSA dans du D2O à des concentrations comprises entre 1 et 50 mg ml-1 ont été placés sur le cristal ATR et les spectres FTIR ont été enregistrés. La sensibilité, ou pente m de régression linéaire, a été utilisée pour le calcul de la limite de détection (LOD), comme suit : LOD = 3 ⋅ RMS-bruit ⋅ m−1. Le bruit quadratique moyen (RMS) de l'instrument a été mesuré dans la région spectrale entre 1550 et 1650 cm-1 (avec le nombre respectif de balayages) et la pente de la droite d'étalonnage a été déterminée à 1597 cm-1.

Toutes les mesures (séries de concentration et de dénaturation) avec le capteur QCLD monolithique suivent la même routine : une mesure de référence dans du D2O pur est d'abord effectuée (temps moyen par point de données : 2 s, temps d'acquisition de données typique : 30 à 60 s) comme une ligne de base, directement suivie par la mesure de la BSA. Il en résulte une mesure de référence individuelle et précise pour chaque mesure contenant du BSA. Dans le cas de la mesure de dénaturation dans la cellule microfluidique, nous avons rincé la cellule pendant au moins 60 s avec l'analyte à la concentration fixée. Après chaque mesure, nous avons purgé, c'est-à-dire nettoyé, le capteur pendant plusieurs minutes avec du D2O pour éliminer les résidus de l'exposition précédente à la BSA de la surface de la puce.

Il convient de noter que la puce a été immergée et a fonctionné dans une solution liquide pendant plus de 40 h au total. Cela comprend des mesures d'étalonnage et de purge avec du D2O pur ainsi que des mesures avec du BSA dans du D2O. Le temps de fonctionnement total dans un liquide se sépare en temps avec et sans polarisation appliquée.

Les mesures d'absorption sur puce de BSA ont été effectuées sur la base de la routine en 3 étapes suivante :

(i) Chauffage : un bécher contenant 35 ml de BSA dissous dans du D2O est préparé avec trois concentrations différentes : 20, 40 et 60 mg ml-1. L'analyte est ensuite constamment chauffé (vitesse de chauffage : ~0,1 ∘C) de ~20 ∘C à ~90 ∘C tout en étant pompé en continu par une pompe péristaltique (Ismatec Reglo ICC, 3 canaux, 8 rouleaux) à un débit de 1 ml min-1 à la partie de refroidissement de la configuration à l'aide de tubes microfluidiques appropriés.

(ii) Refroidissement : pour un refroidissement rapide de l'analyte liquide à la température de mesure de 21 ∘C, le tube microfluidique est guidé à travers un bécher avec de l'H2O déminéralisé thermiquement stabilisé à ~ 20 ∘C. En raison du faible volume de la solution BSA dans le tube microfluidique, quelques secondes dans le liquide de refroidissement suffisent pour le refroidir efficacement, même à partir de la température de chauffage maximale de 90 ∘C. Ceci est confirmé par aucune élévation de température observable dans la cellule de mesure à l'échelle du microlitre pour aucune des températures appliquées du bain chauffant.

(iii) Conduite et mesure : enfin, le liquide est pompé dans la cellule en aluminium microfluidique sur mesure (volume : 60 μl) qui est montée au-dessus de la puce du capteur pour démontrer ses capacités de mesure en microlitres. Tout en stabilisant la température de toute la cellule à 21 ∘C, la mesure est effectuée en polarisant le QCL correspondant qui fonctionne à 1620 cm−1 (impulsions : 100 ns, fréquence de répétition : 5 kHz, générateur d'impulsions Avtech AVL-2-B) et lecture du signal QCD sur puce à l'aide d'un oscilloscope 350 MHz (Teledyne LeCroy HDO4034 2,5 GSPS). L'échantillon est ensuite pompé hors de la cellule microlitre et est éliminé.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les données générées dans cette étude ont été déposées dans la base de données Zenodo sous le code d'accession https://doi.org/10.5281/zenodo.6930083.

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Wacht, D. et al. Revêtement de zircone mésoporeux pour les applications de détection utilisant la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier à réflexion totale atténuée (ATR FT-IR). Appl. Spectrosc. 76, 141–149 (2022).

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Les discussions fructueuses avec W. Schrenk et E. Gornik sont grandement appréciées. Nous remercions A. Linzer et IC Doganlar pour l'assistance technique experte. BH et MD ont reçu un financement du programme-cadre Horizon 2020 de l'UE (projet cFlow, n° 828893). Ce travail a été financé par le COMET Center CHASE (projet n° 868615) dans le cadre du programme COMET - Centres de compétence pour les excellentes technologies par le BMK, le BMDW et les provinces fédérales de Haute-Autriche et de Vienne. Le programme COMET est géré par l'Agence autrichienne de promotion de la recherche (FFG). BH reconnaît le financement par le Fonds scientifique autrichien FWF (M2485-N34) et AS via (projet n° P32644-N). PLS reconnaît le soutien reçu de CAPES-Brésil (88887.477460/2020-00). Le projet CzechNanoLab LM2018110 financé par MEYS CR est remercié pour le soutien financier des mesures au CEITEC Nano Research Infrastructure. L'AMA reconnaît le financement de l'EOARD/AFOSR (FA8655-22-1-7170) et du FFG sous le numéro d'accord de subvention (883941, "Green Sensing MIR").

Institute of Solid State Electronics & Center for Micro- and Nanostructures, TU Wien, 1040, Vienne, Autriche

Borislav Hinkov, Florian Pilat, Patricia L. Souza, Mauro David, Daniela Ristanić, Benedikt Schwarz, Hermann Detz, Aaron M. Andrews et Gottfried Strasser

Institute of Chemical Technologies and Analytics, TU Wien, 1060, Vienne, Autriche

Laurin Lux, Andreas Schwaighofer & Bernhard Lendl

LabSem-CETUC, Université catholique pontificale de Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brésil

Patricia L. Souza

CEITEC, Université de technologie de Brno, Brno, République tchèque

Herman Detz

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BH, FP, LL, PLS et AS ont conçu les expériences et effectué les mesures de liquide ; PLS a caractérisé les dispositifs à cascade quantique ; HD et AMA ont développé les structures de cascade quantique ; DR et BS ont fabriqué les appareils ; MD a effectué des simulations numériques; BH et AS ont analysé les résultats ; BH a écrit le manuscrit avec la contribution éditoriale de FP, AS, AMA, BL et GS ; tous les auteurs ont lu le manuscrit et commenté l'article.

Correspondance à Borislav Hinkov.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Chris Phillips et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

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Réimpressions et autorisations

Hinkov, B., Pilat, F., Lux, L. et al. Un laboratoire sur puce à infrarouge moyen pour la surveillance dynamique des réactions. Nat Commun 13, 4753 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32417-7

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Reçu : 14 février 2022

Accepté : 29 juillet 2022

Publié: 13 août 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-32417-7

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