Mesure de l'hémolyse dans le sérum bovin par UV direct

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 13523 (2022) Citer cet article

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Une procédure simple et rapide est nécessaire pour la détection et la quantification de routine de l'hémolyse, l'une des principales sources de résultats non fiables dans l'analyse du sérum. Dans cette étude, nous avons comparé deux approches différentes pour la détermination rapide de l'hémolyse dans le sérum bovin. La première consistait à estimer l'hémolyse par une simple mesure spectrophotométrique directe dans l'ultraviolet-visible (UV-VIS) d'échantillons de sérum. La seconde impliquait l'analyse des données de couleur rouge, vert, bleu (RVB) extraites d'images numériques d'échantillons de sérum et reliant la teneur en hémoglobine (Hb) au moyen d'étalonnages univariés (R, G, B et intensité séparément) et multivariés (R , G, B et intensité conjointement) en utilisant la régression des moindres carrés partiels et des réseaux de neurones artificiels. L'analyse UV-VIS directe et l'analyse RVB multivariée utilisant des méthodes de réseau de neurones étaient toutes deux appropriées pour évaluer l'hémolyse dans des échantillons de sérum de bovins. Les procédures ont montré une bonne précision (récupérations moyennes de 100,7 et 102,1 %, respectivement), une précision adéquate (avec des coefficients de variation de 0,21 à 2,68 %), une limite de détection (0,14 et 0,21 g L–1, respectivement) et une linéarité de jusqu'à à 10 g·L–1.

L'hémolyse est la rupture des membranes érythrocytaires avec la libération subséquente du contenu cellulaire dans le liquide environnant. Cela peut se produire en raison d'une manipulation inadéquate des échantillons ou d'une pathologie. L'hémolyse se produit généralement in vitro en raison d'une extraction, d'un transport, d'une préparation ou d'un stockage incorrects de l'échantillon. L'hémolyse in vivo est moins fréquente et se produit avant le prélèvement sanguin en raison de conditions pathologiques telles que des infections, des effets toxiques, des maladies à médiation immunitaire, des troubles héréditaires des globules rouges, une coagulation intravasculaire disséminée et des facteurs mécaniques et autres1. L'hémolyse in vivo peut avoir des conséquences graves pour les patients, et des tests sont donc effectués dans le but de distinguer l'hémolyse in vivo de l'hémolyse in vitro, car toute suspicion d'origine pathologique doit faire l'objet d'investigations plus approfondies.

Quelle qu'en soit l'origine, l'hémolyse est la première cause de rejet d'échantillon en pathologie clinique humaine2 et elle est également susceptible d'être une erreur fréquente en médecine vétérinaire3. L'hémolyse peut modifier les résultats analytiques via la libération de composants intracellulaires dans le plasma, la dilution de l'échantillon ou la production d'interférences spectrophotométriques ou chimiques4. Les résultats de l'analyse sanguine de routine peuvent varier en fonction du degré d'hémolyse, de l'espèce animale impliquée et de la méthode et de l'instrument utilisés dans l'analyse. Des erreurs de calcul dues à l'hémolyse ont été signalées pour divers analytes tels que l'alanine aminotransférase (ALT), l'aspartate aminotransférase (AST), la g-glutamyltransférase (GGT), la créatine kinase (CK), la lactate déshydrogénase (LDH), la lipase, la bilirubine totale, l'albumine, glucose, créatinine, urée, calcium, cuivre, fer, magnésium, molybdène, sélénium, zinc, potassium, sodium et chlorure5,6,7,8,9,10,11. L'ampleur de la différence est très variable, car pour certains analytes, la relation avec le degré d'hémolyse est linéaire, comme pour le fer, le zinc, le potassium et la bilirubine, tandis que, par exemple, le calcium et le chlorure présentent une relation non linéaire, ce qui pourrait conduire à une mesure significative. erreurs1,7. De plus, l'hémolyse peut également interférer avec les dosages immunologiques et les tests de coagulation12,13. Le contrôle préanalytique de l'hémolyse est donc une bonne pratique.

La détection visuelle est le moyen le plus simple de déterminer l'hémolyse dans un échantillon, car la couleur varie en fonction du degré d'hémolyse. Cependant, plusieurs études14,15 ont démontré que l'examen visuel est un moyen peu fiable d'évaluer l'hémolyse et que cette pratique pourrait influencer les décisions cliniques16. Ainsi, bien qu'une concentration d'hémoglobine libre (Hb) ≥ 0,5 g L–1 soit considérée comme cliniquement significative pour les tests les plus sensibles à l'hémolyse17, certains chercheurs considèrent qu'une détection visuelle fiable de concentrations inférieures à 2 g L–1 peut être difficile18 en raison de la variations individuelles de la couleur du sérum. Par conséquent, l'inspection visuelle des échantillons pourrait produire des résultats biaisés, et certains analytes comme la LDH et l'AST seraient affectés même lorsqu'une concentration d'Hb dans le sérum inférieure à 0,5 g L–1 est détectée8. Pour ces raisons, la quantification de l'hémolyse est importante afin d'éviter le rejet inutile d'échantillons. Des mesures objectives doivent donc être utilisées pour déterminer si les échantillons doivent être rejetés ou acceptés sur la base du seuil d'acceptabilité requis pour chaque type d'analyse. De plus, l'évaluation de l'hémolyse pourrait également être utile pour indiquer le sens d'un éventuel biais dans les paramètres, même si l'utilisation de formules correctives est généralement déconseillée2.

La nécessité d'estimer le degré d'hémolyse a poussé les fabricants d'appareils automatisés (notamment en biochimie clinique) à développer des techniques basées sur l'indice d'hémolyse (HI). Le HI est une mesure liée à la couleur rouge du sérum, qui est presque exclusivement causée par l'Hb dérivée des globules rouges rompus. Cependant, l'IH est estimé de manière différente dans les différents dispositifs disponibles, et il y a un manque d'harmonisation des méthodes utilisées pour détecter et quantifier l'hémolyse par les différents fabricants19. De plus, les laboratoires plus petits et moins bien équipés et les laboratoires où les échantillons de sang ne sont analysés qu'occasionnellement peuvent ne pas disposer d'appareils automatisés pour mesurer l'IH. Ainsi, l'objectif principal de la présente étude était de développer une méthode simple pour quantifier le degré d'hémolyse dans les échantillons de sérum dans les laboratoires où les dispositifs automatisés ne sont pas disponibles. Deux méthodes différentes ont été dosées dans des échantillons de sérum bovin. La première méthode est basée sur la mesure directe de la couleur du sérum par spectrophotométrie ultraviolet-visible (UV-VIS), car la plupart des laboratoires disposent généralement de l'équipement spectrophotométrique. Les deuxièmes méthodes d'estimation de l'hémolyse sont basées sur des données RVB provenant d'images numériques d'échantillons de sérum. Les informations RVB sont extraites des images numériques des échantillons à l'aide d'un logiciel de traitement d'images gratuit, et à partir de ces données, la prédiction du degré d'hémolyse est faite au moyen d'une régression partielle des moindres carrés ou d'un réseau de neurones artificiels. Ce système de mesure de l'hémolyse pourrait potentiellement être utilisé par de petits laboratoires de terrain où l'équipement spectrophotométrique n'est pas disponible, ou par des cliniciens qui doivent déterminer la pertinence et la qualité des échantillons de sérum avant de les envoyer à un laboratoire spécialisé, car une catégorisation incorrecte des échantillons est la principale cause d'hémolyse dans la phase préanalytique1.

La collecte de données a été effectuée conformément à la directive 2010/63/UE sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques20, et l'essai était conforme à la législation espagnole sur les soins aux animaux21. Les procédures ont été approuvées par le comité de bioéthique de l'hôpital universitaire vétérinaire Rof-Codina, Université de Saint-Jacques-de-Compostelle (Espagne) (AELU001/21/INVMED(02)/Animal(05)/MM/01). L'étude est rapportée conformément aux directives ARRIVE.

Le sang a été prélevé de la veine jugulaire de dix vaches Holstein-Friesian en bonne santé utilisées pour l'enseignement des méthodes d'examen clinique et hébergées à l'Hôpital d'enseignement vétérinaire Rof-Codina, Faculté de médecine vétérinaire, Université de Saint-Jacques-de-Compostelle (Espagne).

Trois types d'échantillons de sang ont été prélevés sur chaque vache, pour obtenir du sérum, pour préparer l'hémolysat et pour l'analyse hématologique. Des échantillons de sang total prélevés dans des tubes de sérum de 9 ml (Vacuette®, CAT Serum Clot Activator; Greiner bio-one, Kremsmünster, Autriche) ont été centrifugés à 1500 g pendant 15 min dans les 4 h suivant le prélèvement pour donner du sérum. Les tubes de sérum ont été stockés à -20 ºC pour une analyse plus approfondie. L'hémolysat a été obtenu en congelant (–20 ºC) des échantillons de sang total prélevés dans des tubes de 9 mL contenant de l'héparine sodique (Vacuette®, NH héparine sodique, Greiner bio-one, Kremsmünster, Autriche). L'analyse hématologique a été réalisée sur des échantillons de sang total prélevés dans des tubes de 6 mL contenant de l'acide éthylènediamine-tétraacétique (EDTA) (Vacuette®, K2E EDTA K2, Greiner bio-one, Kremsmünster, Autriche).

Chaque échantillon de sérum a été divisé en sept sous-échantillons, auxquels des quantités croissantes d'hémolysat ont été ajoutées pour produire une hémolyse à 0,0 %, 0,2 %, 0,5 %, 1,0 %, 2,5 %, 5,0 % et 10 % (Fig. 1). Le degré d'hémolyse, exprimé en grammes d'Hb par litre, a été calculé à partir de la concentration d'Hb de chaque échantillon de sang total déterminée dans un compteur de cellules sanguines automatisé. La relation entre la concentration d'Hb dans les échantillons, y compris les points individuels superposés et le degré d'hémolyse dans la plage de 0,0 à 10 %, est indiquée dans un graphique en boîte à moustaches (Fig. 2). La concentration d'Hb varie légèrement avec le degré d'hémolyse en raison de la variabilité naturelle de la teneur en Hb et de l'Hb sanguine libre dans les érythrocytes de différents individus. Par conséquent, un total de 70 échantillons d'hémolyse gradués ont été utilisés dans les différentes méthodes proposées.

Couleur des échantillons de sérum contenant différentes concentrations d'hémoglobine (Hb) (de gauche à droite : 0,0, 0,2, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0 et 10 g L–1, respectivement). (Prise dans notre laboratoire de la Faculté de médecine vétérinaire de l'Université de Saint-Jacques-de-Compostelle le 24 mai 2022 par C. Herrero Latorre à l'aide d'un Apple Iphone 12).

Diagramme en boîte et en moustaches de la concentration sérique d'hémoglobine (Hb) en fonction du degré d'hémolyse des échantillons.

Un compteur de cellules sanguines automatisé (ProCyte Dx, IDEXX Laboratories, Westbrook, Maine, USA), basé sur une combinaison de technologies de cytométrie en flux laser à fluorescence et d'impédance à flux laminaire, a été utilisé pour produire des numérations globulaires complètes. Les paramètres hématologiques étaient normaux chez toutes les vaches22. Les mesures spectrophotométriques UV-VIS ont été effectuées dans un spectrophotomètre Thermo Scientific Genesys 6 (Thermo Electron Corporation, Madison, USA). Les échantillons de sang ont été centrifugés dans une centrifugeuse iFuge-D06 (Neuation Technologies, Gujarat, Inde).

Les images numériques ont été obtenues dans un système interne décrit en détail dans un article précédent23. En bref, le système comprend un appareil photo reflex numérique (Canon-50D) fonctionnant sous une lumière contrôlée émise par une LED blanche. L'appareil photo était équipé d'un objectif macro Sigma 105 mm f/2,8 et il était piloté à distance depuis un ordinateur portable avec le logiciel de contrôle fourni par le fabricant (EOS Utility 2.14.10). Les images numériques ont été traitées pour obtenir des données RVB avec le logiciel ImageJ 1.52a, développé par les National Health Institutes, USA (disponible gratuitement sur http://imagej.nih.gov/ij). Des procédures d'étalonnage multivariées de régression univariée et des moindres carrés partiels et d'autres calculs statistiques ont été effectués avec Statgraphics Centurion XVIII, version 18.1.12 (Statistical Graphics, Rockville, Madison, États-Unis). Les réseaux de neurones ont été développés à l'aide de WinNN32, version 1.6a (Y. Danon. Arad, Israël). D'autres calculs statistiques (comme le test conjoint pour la pente et l'ordonnée à l'origine) ont été effectués à l'aide de la bibliothèque Ellipse sur l'environnement logiciel libre de calcul statistique et graphique R, version 4.0.5 (R Foundation for Statistical Computing, Vienne, Autriche).

L'hémoglobine est la principale molécule intracellulaire des globules rouges et est donc le meilleur indicateur du degré d'hémolyse dans les échantillons sanguins. La concentration d'Hb dans les échantillons d'hémolyse graduée a été mesurée par la méthode de la cyanméthémoglobine (la méthode de référence internationale pour mesurer la concentration d'Hb) avec un kit de dosage de laboratoire (Spinreact, Girona, Espagne). Fondamentalement, l'Hb est oxydée par le ferricyanure de potassium en méthémoglobine, qui est convertie par le cyanure de potassium en cyanméthémoglobine (CNMHb). L'intensité de la couleur formée (mesurée à 540 nm par spectrophotométrie UV-VIS) est directement proportionnelle à la concentration en Hb dans l'échantillon. Les résultats obtenus à l'aide des méthodes proposées décrites dans les deux sections suivantes ont été comparés à ceux générés par cette procédure basée sur le CNMHb.

L'hémoglobine peut être estimée par mesure spectroscopique directe d'échantillons de sérum à 540 nm, qui est l'un des principaux pics d'absorbance de ce composé et de ses dérivés. Dans la présente étude, cette méthode de mesure directe a été appliquée à des dilutions (1:10) des échantillons d'hémolyse gradués.

Cette méthode est basée sur les informations de couleur fournies par des images numériques uniques des échantillons. Des échantillons de sérum hémolysé ont été placés dans des cuvettes de spectrophotomètre (1,75 ml), qui ont été maintenues à une distance fixe (15 cm) du plan focal de la caméra. Dans tous les cas, les images ont été capturées à l'aide d'une mise au point manuelle, ciblant le point central de la cuvette, avec les paramètres suivants : balance des blancs personnalisée fixe (5 200 K), ouverture f2,8, temps d'exposition 1/10 s et sensibilité photographique 100 ASA. Les images ont été obtenues par une opération informatique à distance pour empêcher les mouvements indésirables de la caméra, et toutes les images ont été directement stockées sur le disque dur de l'ordinateur sous forme de fichiers jpeg non compressés. Des expériences antérieures ont démontré que le format jpeg est préférable à d'autres formats tels que les fichiers bruts ou tiff23. Les histogrammes RVB extraits des fichiers jpeg conservaient les informations de couleur dans des fichiers plus petits que les fichiers bruts ou tiff, permettant une manipulation plus rapide et occupant beaucoup moins d'espace disque. Les valeurs R, G, B et d'intensité pondérée ont été extraites des photographies avec ImageJ, un programme de traitement d'image open source conçu pour les images multidimensionnelles. Pour chaque échantillon, les valeurs RVB, indiquant l'intensité des couleurs rouge, verte et bleue, ont été extraites de chaque image avec le logiciel ImageJ. Chaque valeur d'intensité est exprimée sur une échelle de 0 à 255 (256 canaux) où des numéros de canaux plus élevés indiquent des couleurs plus claires. La valeur de la couleur, considérée comme le signal analytique, est liée à la concentration en Hb. Dans le cas présent, deux procédures d'étalonnage différentes ont été dosées : i) étalonnage univarié avec chacune des valeurs R, G, B et d'intensité ; et ii) étalonnage multivarié basé sur les quatre variables R, G, B et d'intensité conjointement au moyen d'une régression partielle des moindres carrés (PLSR) et d'un réseau de neurones artificiels à rétroaction multicouche (MLF-ANN).

Une matrice de données (X70x7) a été construite à partir des données de l'échantillon. Dans tous les cas, les lignes (70) correspondaient aux échantillons de sérum hémolysé et les colonnes (7) aux valeurs numériques des sept variables caractérisant les échantillons : (1) le code de l'échantillon ; (2) la valeur de l'Hb déterminée par la méthode CNMHb ; (3) l'absorbance des échantillons mesurée à 540 nm par spectrophotométrie UV-VIS ; et (4–7) respectivement les valeurs de R, G, B et l'intensité pondérée obtenues à partir des images numériques avec le logiciel ImageJ.

La matrice de données a été soumise à différentes calibrations chimiométriques univariées et multivariées pour explorer la relation entre la concentration en Hb et le(s) signal(s) analytique(s) considéré(s). Dans la méthode spectrophotométrique UV-VIS directe, un étalonnage univarié a été effectué pour l'absorbance à 540 nm et la valeur de l'Hb déterminée par CNMHb. Dans les procédures RVB, l'étalonnage univarié et multivarié a été dosé. Dans l'approche univariée, les valeurs R, G, B et d'intensité pondérée ont été tracées par rapport à la valeur de CNMHb-Hb. Pour les étalonnages multivariés, un ensemble de quatre variables prédictives X (R, G, B et intensité pondérée) et une réponse Y dépendante (teneur en Hb) ont été prises en compte. Deux approches différentes (PLSR et MLF-ANN) ont été utilisées pour construire différents modèles mathématiques de prédiction. La méthode PLSR consiste à dériver la relation complexe entre les variables X et la réponse Y. Pour la prédiction (déterminée par validation croisée), un nombre limité de facteurs latents (LF) ont été construits au moyen de PLSR. Les LF sont associés à des directions dans l'espace factoriel liées à une forte variation de la réponse Y, et ils sont biaisés pour obtenir la meilleure prédiction (pour une explication plus détaillée, voir Geladi et Kowalski24). D'autre part, MLF-ANN est une technique de reconnaissance de formes puissante qui développe des modèles sur la base d'un ensemble d'échantillons d'entrée/sortie (données de couleur RVB et contenu Hb) mettant à jour et modifiant les poids entre les connexions neuronales pour produire une sortie adéquate pour chaque entrée. Ainsi, les poids des connexions fournissent des informations utiles sur la relation entre les données de couleur d'entrée et la teneur en Hb de sortie. Cependant, ces informations ne sont pas interprétables chimiquement25.

Les stratégies de validation étaient différentes pour les approches univariées et multivariées. Pour les méthodes univariées, l'ensemble de 70 échantillons a été divisé en sous-ensembles d'étalonnage (49 échantillons : 70 % du total) et de validation (21 échantillons, 30 %). L'attribution des échantillons à chaque sous-ensemble a été effectuée au hasard mais en tenant compte des différentes concentrations d'Hb. Cet arrangement d'échantillons a fourni suffisamment d'informations pour la construction de modèles univariés et une validation appropriée avec les échantillons restants. Pour les calages multivariés (PLSR et MLF-ANN), les modèles doivent être construits en utilisant le plus d'informations possible et il est vrai que la situation optimale serait d'avoir un grand nombre d'échantillons qui permettrait d'avoir suffisamment d'échantillons pour établir deux grands ensembles pour l'apprentissage et la validation. Dans le cas présent, en raison du nombre limité d'échantillons disponibles, une procédure de validation croisée imbriquée qui produit des estimations de performances robustes et impartiales, quelle que soit la taille réduite de l'échantillon26. 90% des échantillons ont été utilisés pour construire le modèle de prédiction et les 10% restants sont utilisés pour la validation. Selon cette distribution d'ensembles, une procédure de validation croisée imbriquée décuple a été réalisée avec différentes constitutions d'ensembles d'apprentissage et de validation assurant l'indépendance entre les deux ensembles et développant un modèle différent à chaque étape. La performance globale a ensuite été calculée comme une moyenne des performances de classification des 10 modèles développés séparément sur différents ensembles de 10 % de données de validation qui n'ont pas été impliqués dans le développement des modèles26. La précision a été évaluée en termes de tests de reproductibilité intermédiaires en évaluant le coefficient de variation (CV = SD/\(\stackrel{\mathrm{-}}{\text{x}}\)*100) pour dix mesures de répétitions à trois différents niveaux de concentration (0,5, 2,5 et 10%), préparés avec différents échantillons de sérum et mesurés par différents opérateurs. La linéarité de la réponse pour toutes les méthodes développées a été testée jusqu'à 10 % de teneur en Hb, et la limite de détection (LOD) a été calculée à 3 fois et la LOQ à 10 fois l'écart type des dix (n = 10) blancs de sérum . La précision a été évaluée en comparant les concentrations d'Hb obtenues par chaque méthode développée avec celles obtenues par la méthode CNMHb.

L'étude est conforme aux directives et réglementations en vigueur.

Les 49 échantillons d'étalonnage ont été utilisés pour confirmer la relation entre la concentration d'Hb et l'absorbance à 540 nm dans les échantillons de sérum bovin. La relation suit la loi de Lambert-Beer, présentant un modèle linéaire décrit par Absorbance = (0,1051 ± 0,0075) + (0,0873 ± 0,0017) (Hb), avec un coefficient de corrélation de 0,991 (Fig. 3a). Ce résultat a également été vérifié par ANOVA, et la relation linéaire entre l'absorbance et l'Hb s'est avérée significative (P < 0,05).

( a ) Courbe d'étalonnage pour la concentration d'hémoglobine (Hb) préparée à partir d'un ensemble d'étalonnage pour la méthode spectrophotométrique UV-VIS directe. (b) Prédiction des niveaux de concentration d'hémoglobine (Hb) à l'aide de la méthode spectrophotométrique UV-VIS directe pour les échantillons de validation par rapport à ceux fournis par la méthode CNMHb.

Une fois que la relation linéaire appropriée entre l'absorbance et la concentration d'Hb dans les échantillons de sérum bovin a été démontrée, différentes études ont été menées pour établir les chiffres analytiques de mérite en ce qui concerne l'exactitude, la précision, la linéarité, la LOD et la limite de quantification (LOQ) de la méthode. . La précision a été évaluée en prédisant la concentration d'Hb dans les 21 échantillons connus de l'ensemble de validation. Après mesure de l'absorbance à 540 nm dans ces échantillons, la courbe d'étalonnage obtenue a été utilisée pour prédire la concentration en Hb. La concentration en Hb déterminée par UV-VIS a été tracée par rapport à la concentration mesurée à l'aide de la méthode CNMHb (Fig. 3b). La régression linéaire est probablement l'approche la plus couramment utilisée pour comparer différentes méthodes analytiques. Selon cette approche, si les deux méthodes testées donnent des résultats comparables, la droite de régression entre le test et les méthodes de référence doit donner une droite non significativement différente de la droite d'égalité (caractérisée par une pente égale à 1 et une ordonnée à l'origine égal à 0). Un écart par rapport à la ligne d'égalité indique un manque de concordance entre les deux méthodes. Dans le cas présent, la régression linéaire entre la concentration en Hb déterminée par UV–VIS et la concentration obtenue par la méthode de référence produit une droite dont l'équation de régression des moindres carrés est prédite UV–VIS = (0,0816 ± 0,1257) + ( 0,9688 ± 0,034) * (Hb), avec un coefficient de corrélation de 0,988. La ligne résultante est proche de la ligne d'égalité : les intervalles de confiance à 95 % pour la pente (0,935–1,0032) et l'ordonnée à l'origine (− 0,0441–0,2073) incluent respectivement les valeurs 1,0 et 0,0. Ainsi, les résultats fournis par la mesure UV-VIS sont comparables à ceux produits par la méthode CNMHb. Un test apparié comparant les concentrations d'Hb obtenues par les deux méthodes a été réalisé pour vérifier ce résultat. Pour les 21 échantillons de l'ensemble de validation, la moyenne de la différence \({\overline{\text{X}}}\)d était de 0,0115 et l'écart type de la différence Sd était de 0,455. Selon ces données, la valeur de tcal = (\({\overline{\text{X}}}\)d \(\sqrt{\mathrm{n}}\))/Sd était de 0,116. Comme tcal est inférieur à t(95%, n−1), on peut confirmer que la méthode UV-VIS a donné des résultats pour l'Hb comparables à ceux obtenus par la méthode CNMHb de référence, avec un seuil de signification de 0,05. En fait, la récupération moyenne des échantillons à partir de la validation par les déterminations UV-VIS était de 93,6 % (voir tableau 1).

Dans le cas de la méthode RVB, deux approches d'étalonnage différentes ont été appliquées : l'étalonnage univarié et l'étalonnage multivarié. Lorsque l'étalonnage univarié a été testé pour les quatre paramètres de couleur extraits des images d'échantillons de l'ensemble d'étalonnage, les valeurs de G, B et d'intensité n'étaient pas bien corrélées avec la concentration d'Hb. La seule variable de couleur présentant une relation linéaire avec la concentration en Hb était la variable R (correspondant aux tons rouges). Ce résultat était attendu car la couleur des solutions de sérum est dans la gamme rouge (du jaune-orange au rouge intense) (Fig. 1).

Dans le but de présenter une courbe d'étalonnage utilisant un signal analytique similaire à ceux obtenus pour la méthode UV-VIS, le signal analytique R brut a été transformé en Redbance (similaire à l'absorbance), calculé comme suit :

où R est la valeur des données R extraites pour l'échantillon considéré, et 256 est le nombre total de canaux RVB dans la plage rouge. En utilisant cette amplitude pour le signal analytique, Redbance varie entre 0 pour les solutions incolores et 2,4 pour les solutions rouges les plus foncées. Selon ce signal analytique, la relation entre Redbance et la concentration d'Hb dans les échantillons de sérum bovin suivait une relation linéaire, décrite par Redbance = (0,0929 ± 0,0021) + (0,0187 ± 0,0005) (Hb), avec un coefficient de corrélation de 0,983. Cependant, comme déduit de ces résultats et vu sur la figure 4a, les résultats n'étaient pas aussi satisfaisants que les résultats UV – VIS, présentant une plus grande dispersion des données pour les échantillons d'étalonnage. La droite de régression de la concentration d'Hb déterminée et de la valeur de référence (Fig. 4b) est une droite légèrement différente de la droite d'égalité, et de fait, l'intervalle de confiance de la pente (0,824–0,914) ne comprend pas de valeur de 1,0. Cela conduit à une surestimation des concentrations d'Hb pour les valeurs inférieures à 5 % et à une sous-estimation pour les valeurs supérieures à 5 %.

( a ) Courbe d'étalonnage pour la concentration d'hémoglobine (Hb) préparée à partir de l'ensemble d'étalonnage pour la méthode univariée RVB (basée sur R). (b) Prédiction des niveaux de concentration d'hémoglobine (Hb) à l'aide de la méthode RVB univariée (basée sur R) pour les échantillons de validation par rapport à ceux fournis par la méthode CNMHb.

Dans l'étalonnage multivarié, deux procédures différentes ont été utilisées pour construire le modèle mathématique de prédiction de la concentration d'Hb dans le sérum sur la base des quatre variables de couleur. Le premier était basé sur la régression PLS, tandis que le second utilisait MLF-ANN.

Le PLSR a été appliqué aux 70 échantillons de matrice de données avec les quatre variables X (R, G, B et intensité pondérée) et la réponse Y (Hb). La division précédente entre les ensembles d'étalonnage et de validation a été supprimée parce que dans le cas présent, une validation croisée décuple a été effectuée comme décrit dans la section des méthodes. Le modèle a été ajusté à l'ensemble d'apprentissage composé de 90 % d'échantillons, et il a été utilisé pour prédire 10 % des échantillons dans l'ensemble de validation. Le processus doit être répété 10 fois afin de garantir que tous les échantillons sont inclus dans l'ensemble de validation au moins une fois (cette stratégie de validation a évidemment un coût de calcul élevé ; cependant, ce n'est pas un problème pour les processeurs informatiques actuels et les progiciels chimiométriques modernes qui peut automatiser cette procédure). Dans la présente étude, un rang de modèle à trois LF a été sélectionné comme optimal, retenant respectivement 99,9 et 98,1 % de la variance X et Y totale. La variance expliquée pour la réponse dans la prédiction était de 97,6 %. Les valeurs prédites pour les échantillons de validation par rapport à la valeur d'Hb de référence sont présentées dans la Fig. 5. Les résultats sont clairement une amélioration par rapport à l'approche univariée. L'équation linéaire obtenue était : PLSR Predicted = (0,051 ± 0,0.069) + (0,9807 ± 0,0170) (Hb), R = 0,990. Si la droite obtenue est compatible avec la droite d'égalité (avec pente = 1 et ordonnée à l'origine = 0), alors cela signifie que la méthode RGB-PLSR produit des résultats comparables à la méthode de référence. Un test basé sur la définition d'une région de confiance conjointe pour l'ordonnée à l'origine βo et la pente β1 (qui est une ellipse) a été appliqué pour vérifier ce critère. Dans le cas présent, la région de confiance à 95 % obtenue comprenait des valeurs de βo = 0 et β1 = 1. Ensuite, avec un niveau de confiance de 95 %, la méthode RGB-PLSR a obtenu des résultats compatibles avec la méthode de référence CNMHb pour la mesure de l'hémoglobine. Ainsi, les quatre variables de couleur contiennent ensemble suffisamment d'informations pour prédire correctement la concentration d'Hb. Dans une tentative d'améliorer la capacité prédictive des modèles basés sur RVB, un autre étalonnage multivarié a été construit à l'aide d'un réseau de neurones artificiels à rétroaction multicouche.

Prédictions des niveaux de concentration d'hémoglobine (Hb) à l'aide de la méthode RGB-PLSR pour les échantillons de validation comparées à celles fournies par la méthode CNMHb.

Dans cette section, un MLF-ANN a été utilisé pour prédire la concentration d'Hb sur la base des données brutes pour les quatre mêmes variables de couleur. L'architecture neuronale du réseau MLF a été sélectionnée comme suit. La couche d'entrée était composée de quatre neurones (un nombre égal au nombre de variables de couleur d'entrée) et la couche de sortie était formée d'un neurone, donnant la valeur Hb prédite par le réseau. Le nombre et la taille des couches cachées ont été sélectionnés sur la base de l'erreur quadratique moyenne minimale (RSE) pour l'ensemble de données complet. Le RSE le plus bas a été obtenu à l'aide d'un réseau de neurones à trois couches (4–7-1) et a été utilisé pour d'autres calculs. D'autres architectures de réseau avec 2 couches cachées ont fourni un RSE similaire, mais la structure la plus simple avec trois couches a été préférée. La fonction de transfert utilisée pour les calculs de sortie était sigmoïde : f(x) = 1/(1 + [exp(–x)]). Les poids initiaux des connexions entre neurones ont été choisis au hasard dans la plage de 3 à − 3. Le paramètre de taux d'apprentissage adaptatif η et le momentum i (les paramètres mettant à jour le poids des connexions après chaque époque) étaient respectivement de 0,2 et 0,5, et le le nombre maximum d'époques était limité à 500 pour éviter le surajustement. Pour la validation, une validation croisée décuplée a été appliquée comme décrit ci-dessus. Les concentrations sériques d'Hb prédites par MLF-ANN sont présentées à la Fig. 6. L'ANN fournit des résultats encore meilleurs que le PLSR. La comparaison entre les valeurs prédites ANN et la concentration d'Hb de référence était appropriée, suivant une ligne ajustée ANN-prédit = (0,0270 ± 0,0348) + (0,9916 ± 0,0083) (Hb), avec un coefficient de corrélation de 0,997. La compatibilité avec la ligne d'égalité a été positivement démontrée en utilisant le même test que dans la section précédente. Ainsi, le réseau neuronal optimisé est capable d'extraire des informations utiles à partir de données de couleur brutes, prédisant correctement la concentration en Hb dans des échantillons de sérum, telle que déterminée par la méthode de référence CNMHb.

Prédictions des niveaux de concentration d'hémoglobine (Hb) à l'aide de la méthode RGB-MLF-ANN pour les échantillons de validation comparées à celles fournies par la méthode CNMHb.

En plus d'évaluer la précision exprimée en termes de capacité prédictive des méthodes décrites ci-dessus, d'autres valeurs analytiques de mérite, telles que la précision à trois niveaux de concentration, la LOD et la linéarité, ont été testées. Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau 1. La méthode UV-VIS a donné des résultats adéquats par rapport à la procédure CNMHb. Ainsi, la mesure de l'absorbance à 540 nm est une méthode simple et rapide d'estimation de l'hémolyse dans le sérum bovin. La LOD était la plus faible de toutes les procédures développées, et la linéarité de l'absorbance par rapport à la concentration réelle d'Hb atteignait jusqu'à 10 %. La méthode univariée RVB, basée sur la réponse dans les canaux rouges mesurée en Redbance, a produit des résultats insatisfaisants, car les prédictions pour les échantillons de validation surestimaient la teneur en Hb pour les valeurs faibles et sous-estimaient les valeurs élevées. Cette méthode univariée directe basée sur la couleur a également donné de mauvais résultats en termes de précision (en particulier pour les valeurs de concentration inférieures à 1 %). Ainsi, l'approche RGB-multivariée a amélioré les résultats obtenus. Les prédictions obtenues dans les deux méthodes RVB multivariées basées sur les étalonnages PLSR et MLF-ANN ont produit des résultats similaires à la méthode CNMHb. Cependant, la précision des prédictions par la méthode PLSR et par conséquent les récupérations par cette méthode étaient très faibles pour les faibles valeurs. En revanche, l'étalonnage à l'aide d'un réseau neuronal a donné des résultats adéquats pour la précision, avec un CV compris entre 0,10 et 5,56 %. De plus, la réponse linéaire pour la méthode RGB-ANN a donné jusqu'à 10 % d'Hb, et la récupération moyenne par rapport à la méthode CNMHb était de 102,3 %.

Deux méthodes basées sur la couleur pour déterminer l'hémolyse dans des échantillons de sérum bovin en mesurant la concentration d'Hb ont été testées. Les méthodes spectrophotométriques UV-VIS directes et RGB-MLF-ANN ont produit des résultats satisfaisants, fournissant des résultats statistiquement comparables à ceux obtenus par la méthode de référence CNMHb (P < 0,05). Dans les deux cas, les facteurs de mérite étaient adéquats et l'hémolyse a été détectée à 0,50 g L–1, le niveau minimum qui interfère habituellement avec les résultats des tests sanguins17.

De nombreuses méthodes de mesure de l'Hb ont été développées, car l'Hb est utilisée pour indiquer l'anémie et l'hémolyse in vitro, qui sont toutes deux importantes et se produisent fréquemment en médecine humaine. Historiquement, la mesure de l'Hb s'est appuyée sur des laboratoires bien équipés et sur l'utilisation de procédures chimiques telles que la méthode CNMHb, la méthode de référence pour déterminer les concentrations d'Hb selon l'International Committee for Standardization in Hematology (ICSH)27. Cette approche est basée sur la mesure de l'absorbance à 540 nm du dérivé le plus stable de l'Hb, la cyanméthémoglobine28. Cependant, l'ICSH recommande l'utilisation de cette méthode uniquement par des comités nationaux de normalisation des méthodes hématologiques ou par des titulaires officiels désignés par le gouvernement. L'utilisation de cette méthode dans le test d'hémolyse n'est pas réalisable car elle prend du temps et produit des résidus toxiques. Néanmoins, la méthode est encore fréquemment utilisée dans certains pays29.

De nos jours, les laboratoires du monde entier visent à détecter systématiquement l'hémolyse dans les échantillons en raison de la forte incidence et de l'importance de ce phénomène en pathologie clinique. Comme la procédure est destinée à être réalisée dans tous les types de laboratoires, des méthodes plus rapides et plus simples de détection et de quantification de l'hémolyse sont en cours de développement. La spectrométrie est considérée comme la meilleure méthode d'évaluation de l'Hb libre et, bien que l'utilisation standard de l'IH soit proposée dans plusieurs lignes directrices2,30, il existe une perception généralisée selon laquelle cette recommandation n'a pas été entièrement évaluée19. Le HI calcule le degré d'hémolyse en mesurant l'absorbance d'échantillons de sérum ou de plasma à différentes paires de longueurs d'onde (telles que 570 et 600 nm ou 660 et 700 nm), et cette méthode est maintenant intégrée à la plupart des grands postes de travail. Un certain nombre de méthodes spectrométriques utilisent deux ou plusieurs longueurs d'onde dans des échantillons d'ictère ou de lipémie pour éviter les interférences observées dans les résultats à une seule longueur d'onde.

Dans une étude classique, Malinauskas et al.31 ont utilisé des échantillons bovins pour comparer neuf méthodes spectrophotométriques différentes impliquant l'utilisation de deux et trois longueurs d'onde combinées et deux autres méthodes chimiques pour mesurer l'Hb dans le plasma. Ces auteurs ont conclu que les méthodes spectrométriques étaient plus sûres, plus faciles et plus précises et exactes que les méthodes impliquant l'ajout de produits chimiques. Ces différentes approches sont possibles car les spectres d'absorption de l'Hb permettent d'estimer l'Hb dans une large gamme de longueurs d'onde, avec au moins deux principaux maximums caractéristiques vers 420 et 540 nm32. Le pic de 540 nm a été choisi pour concevoir la méthode de spectrophotométrie directe UV-VIS dans cette étude car de bons résultats ont été obtenus dans d'autres études pour évaluer l'hémolyse chez l'homme et d'autres espèces animales7,33,34,35. D'autres longueurs d'onde proches de ces pics principaux ont également été utilisées. En médecine humaine, une approche spectrophotométrique basée sur λ = 414 nm pour mesurer les faibles niveaux d'hémolyse dans le sérum s'est avérée être une méthode fiable d'identification des échantillons hémolytiques36. Dans ce cas, la méthode proposée a permis de détecter 0,004 % d'hémolyse. D'autres auteurs qui ont étudié les variations potentielles des pics d'absorbance de l'Hb en fonction de la pression partielle d'oxygène (PO2) ont conclu que lorsque la PO2 est supérieure à 100 mm Hg, alors le pic à 576 peut également être utile37. Seules de légères différences dans les spectres d'absorption de l'oxyhémoglobine humaine et bovine sont trouvées38, et par conséquent la technique analytique et la longueur d'onde utilisées dans ces études devraient également être valables chez les patients bovins, comme démontré pour la méthode UV-VIS présentée ici. Dans cette première méthode, l'étalonnage univarié de l'absorbance à 540 nm vs. Dans notre expérience, la teneur en Hb était suffisante pour une bonne prédiction de l'hémolyse dans les échantillons de sérum bovin. Cependant, certaines faiblesses de l'approche à une longueur d'onde développée comprennent les aspects suivants : (1) l'étalonnage effectué avec une seule longueur d'onde peut ne pas être en mesure de distinguer si le signal analytique provient uniquement de l'analyte cible (Hb dans ce cas) ou de certains interférents présents dans la matrice (sérum) qui peuvent augmenter ou diminuer le signal mesuré ; et (2) la difficulté d'effectuer des mesures sur le terrain et l'interférence potentielle du changement de couleur du sérum dans les échantillons lipémiques et ictériques. Malgré ces considérations, sur la base des résultats obtenus, la procédure appliquée ici basée sur une seule longueur d'onde est jugée appropriée car, en plus d'avoir été validée, il s'agit d'une technique simple, rapide, économique, non destructive et disponible pour mesurer hémolyse dans des échantillons de sérum bovin.

Gardant à l'esprit que les méthodes spectrophotométriques peuvent ne pas être réalisables pour les professionnels en conditions de terrain ou pour les petits laboratoires vétérinaires, une deuxième méthode basée sur des données RVB extraites d'une image numérique d'échantillons obtenus avec un simple appareil numérique a été développée. La mise en œuvre de cette méthode sur un téléphone mobile ou un autre appareil mobile constituerait un outil précieux pour les professionnels de terrain afin de vérifier la qualité de l'échantillon avant de l'envoyer à des laboratoires spécialisés. Parmi les différentes approches évaluées, la méthode multivariée RGB-MLF-ANN a produit les meilleurs résultats pour la détermination de l'Hb. Bien que les chiffres analytiques de mérite pour RGB-MLF-ANN aient été légèrement inférieurs à ceux obtenus par la méthode UV-VIS (précision inférieure pour 2,5 % d'hémolyse et LOD légèrement plus élevée), les résultats obtenus par cette procédure étaient également acceptables et similaires à ceux obtenu par la méthode CNMHb (P < 0,05). La méthode peut donc être utilisée pour une mesure fiable de l'hémolyse. Les outils courants tels que les appareils photo numériques et les téléphones sont de plus en plus utilisés dans le domaine scientifique, car ces instruments relativement peu coûteux comprennent le matériel et les logiciels requis pour de telles tâches. Les données RVB ont été utilisées pour accomplir diverses tâches analytiques telles que la détection d'adultérations dans le vieux vin23 et la détermination de la teneur en fer dans le sang, le vin et l'eau39. En science vétérinaire, les caméras qui fournissent des données RVB permettent le développement de méthodes d'identification individuelle des vaches40,41, de mesure et de contrôle des battements cardiaques des bovins42, de division de la chair et des viscères chez les volailles43 et de détection de la détérioration des poitrines de poulet44, entre autres. Dans le domaine médical, divers appareils utilisent la spectrométrie ou les données RVB pour déterminer l'Hb chez l'homme, à la fois par des méthodes invasives45,46 et non invasives47,48,49,50. La plupart de ces instruments et dispositifs ont été conçus pour détecter l'anémie chez les patients humains, mais des méthodes basées sur les téléphones RVB ont également été appliquées pour détecter l'hémolyse in vitro et in vivo51. Archibong et al.52 ont utilisé des valeurs RVB pour détecter l'hémolyse in vivo avec une méthode de téléphone mobile, avec une précision de 0,01 g L–1 d'Hb dans des échantillons de plasma et un coefficient de corrélation de R2 = 0,9703. Lopes et al.53 ont développé une méthode impliquant la vision par ordinateur et les réseaux de neurones (NN). Après entraînement du NN, des valeurs de 0,4 g L–1 d'Hb ont été déterminées. L'appareil a estimé l'hémolyse avec une précision suffisante pour guider la décision du laboratoire lors de la phase pré-analytique du test sanguin. L'utilisation de NN offre des avantages pour l'interprétation des données concernant la non-linéarité, l'apprentissage supervisé, l'adaptabilité et les informations contextuelles. Pour ces raisons, les NN ont été utilisés comme outil de prédiction multivariée pour évaluer l'hémolyse de l'échantillon ainsi que d'autres approches d'étalonnage bien connues, telles que la régression des moindres carrés partiels (PLSR). Ainsi, Kim et al.54 ont utilisé de manière satisfaisante le PLRS pour quantifier les taux sanguins d'Hb par un spectre de réflectance reconstruit à partir de données RVB obtenues à partir du troisième œil de bovin avec une caméra à capteur tricolore. Dans cette étude, les auteurs ont également déterminé les corrélations pour le canal R uniquement, pour la détermination de l'Hb sanguine, concluant que bien que ce canal soit associé à l'Hb (P = 0,047), le coefficient de corrélation était trop faible. Cette découverte soutient l'idée que bien que le canal R puisse être lié au contenu en Hb, l'application d'une approche multivariée est nécessaire pour produire des résultats cohérents et robustes. Dans la méthode RVB univariée évaluée ici, l'utilisation du canal R uniquement (car la relation avec Hb est attendue en raison de la couleur rouge) a également été explorée. Cependant, bien que les résultats aient été meilleurs que ceux obtenus par Kim et al.54 (R2 = 0,973 pour la procédure canal R directe contre R2 = 0,260 pour la procédure canal R), le manque de précision suffisante (avec une forte dispersion des données pour les échantillons d'étalonnage) ainsi que la surestimation des concentrations d'Hb pour les valeurs inférieures à 5 % et la sous-estimation pour les valeurs supérieures à 5 % excluent l'utilisation de cette méthode. L'approche impliquant l'utilisation d'un réseau de neurones multicouches avec apprentissage en avant pourrait être utilisée pour développer de nouvelles procédures basées sur des caméras à faible coût (avec une résolution plus élevée que celle utilisée dans ce travail), ou même des applications de téléphonie mobile pour détecter et quantifier l'hémolyse chez les bovins. à partir d'images numériques. Cela fournira aux professionnels vétérinaires travaillant sur le terrain un outil simple, rapide et facile à utiliser pour une estimation rapide du degré d'hémolyse dans les échantillons bovins.

Les ensembles de données générés pendant et/ou analysés pendant l'étude en cours sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

Simundic, AM, Baird, G., Cadamuro, J., Costelloe, SJ et Lippi, G. Gestion des échantillons hémolysés dans les laboratoires cliniques. Crit. Rév. Clin. Laboratoire. Sci. 57, 1–21 (2020).

Article CAS PubMed Google Scholar

Lippi, G., Cadamuro, J., Von Meyer, A. & Simundic, AM Recommandations pratiques pour la gestion des échantillons hémolysés dans les tests de chimie clinique. Clin. Chim. Laboratoire. Méd. 56, 718–727 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Braun, JP, Bourgès-Abella, N., Geffré, A., Concordet, D. & Trumel, C. La phase préanalytique en pathologie clinique vétérinaire. Vétérinaire. Clin. Pathol. 44, 8–25 (2015).

Article PubMed Google Scholar

Šimundić, AM, Nikolac, N. & Guder, WG Variation préanalytique et processus de préexamen. Dans Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics (eds Rifai, N. et al.) 81–94 (Elsevier, 2018).

Google Scholar

Di Martino, G. et al. Le degré d'acceptabilité des valeurs de sang porcin à des niveaux croissants d'hémolyse évalué par inspection visuelle par rapport à la quantification automatisée. J. Vétérinaire. Diag. Enquête 27, 306–312 (2015).

Article Google Scholar

Jacobs, RM, Lumsden, JH & Grift, E. Effets de la bilirubinémie, de l'hémolyse et de la lipémie sur les analytes de chimie clinique dans les sérums bovins, canins, équins et félins. Peut. Vétérinaire. J. 33, 605–608 (1992).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Killilea, DW et al. Identification d'un seuil d'hémolyse qui augmente la concentration plasmatique et sérique en zinc. J. Nutr. 147, 1218-1225 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Koseoglu, M., Hur, A., Atay, A. & Çuhadar, S. Effets des interférences de l'hémolyse sur les paramètres biochimiques de routine. Biochimie. Médica 21, 79–85 (2011).

Article CAS Google Scholar

Leard, BL, Alsaker, RD, Porter, WP & Sobel, LP L'effet de l'hémolyse sur certains paramètres chimiques du sérum canin. Laboratoire. Anim. 24, 32–35 (1990).

Article CAS PubMed Google Scholar

O'Neill, SL & Feldman, BF L'hémolyse en tant que facteur dans la chimie clinique et l'hématologie du chien. Vétérinaire. Clin. Pathol. 18, 58–68 (1989).

Article PubMed Google Scholar

Larrán, B. et al. Influence de l'hémolyse sur le profil minéral du sérum bovin. Anim. 11, 3336 (2021).

Article Google Scholar

Sodi, R., Darn, SM, Davison, AS, Stott, A. & Shenkin, A. Mécanisme d'interférence par hémolyse dans le dosage immunologique de la troponine T cardiaque. Ann. Clin. Biochimie. 43, 49–56 (2006).

Article CAS PubMed Google Scholar

Nougier, C., Jousselme, E., Sobas, F., Pousseur, V. & Négrier, C. Effets de l'interférence de l'hémolyse, de la bilirubine et de la lipémie sur les tests de coagulation détectés par deux systèmes analytiques. Int. J. Lab. Hématol. 42, 88–94 (2020).

Article PubMed Google Scholar

Hawkins, R. Écart entre l'évaluation visuelle et spectrophotométrique de l'hémolyse de l'échantillon. Ann. Clin. Biochimie. 42, 521-522 (2002).

Article Google Scholar

Simundic, AM et al. Comparaison entre la détection visuelle et la détection automatisée d'échantillons lipémiques, ictériques et hémolysés : pouvons-nous nous fier à un œil humain ?. Clin. Chim. Laboratoire. Méd. 47, 1361-1365 (2009).

CAS PubMed Google Scholar

Luksic, AH et al. L'évaluation visuelle de l'hémolyse affecte la sécurité des patients. Clin. Chim. Laboratoire. Méd. 56, 574-581 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Lippi, G. & Cadamuro, J. Évaluation visuelle de la qualité de l'échantillon : Quo usque tandem ?. Clin. Chim. Laboratoire. Méd. 56, 513-515 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Gomez Rioja, R. et al. Hémolyse dans les échantillons de diagnostic. Rev. du Lab. Clin. 2, 185-195 (2009).

Google Scholar

Lippi, G. Évaluation systématique de l'indice d'hémolyse : avantages et inconvénients. Adv. Clin. Chim. 71, 157-170 (2015).

Article CAS PubMed Google Scholar

Directive 2010/63/UE du Parlement européen et du Conseil du 22 septembre 2010 sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/TXT/?uri= CELEX%3A02010L0063-20190626 (2010).

Décret royal 53/2013, du 1er février, qui établit les règles de base applicables à la protection des animaux utilisés à des fins d'expérimentation et à d'autres fins scientifiques, y compris l'enseignement. https://www.boe.es/buscar/act.php?id=BOE-A-2013-1337 (2013).

Jerry Kaneko, J., Harvey, JJ & Bruss, ML Biochimie clinique des animaux domestiques (Academic Press, 2008).

Google Scholar

Herrero-Latorre, C., Barciela-García, J., García-Martín, S. & Peña-Crecente, RM Détection et quantification des falsifications dans le vin vieilli à l'aide d'images numériques RVB combinées à des techniques chimiométriques multivariées. Chimie alimentaire. X3, 100046 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Geladi, P. & Kowalski, BR Régression partielle des moindres carrés : un tutoriel. Anal. Chim. Acta 185, 1–17 (1986).

Article CAS Google Scholar

Zupan, J. & Gasteiger, J. Réseaux de neurones pour la chimie et la conception de médicaments : une introduction (Wiley-VCH, 1999).

Google Scholar

Vabalas, A. Validation de l'algorithme d'apprentissage automatique avec une taille d'échantillon limitée. PLoS ONE 14, e0224365 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Comité international de normalisation en hématologie. Br. J. Haematol. 13, 71–75 (1967).

Article Google Scholar

van Kampen, EJ & Zijlstra, WG Normalisation de l'hémoglobinométrie II. La méthode de l'hémiglobinecyanure. Clin. Chim. Acta 6, 538–544 (1961).

Article PubMed Google Scholar

Srivastava, T., Negandhi, H., Neogi, SB, Sharma, J. & Saxena, R. Méthodes d'estimation de l'hémoglobine : un examen de "ce qui fonctionne". J. Hématol. Transfus. 2, 2005–2006 (2014).

Google Scholar

Smith, MB et al. Indices d'hémolyse, d'ictère et de lipémie/turbidité comme indicateurs d'interférence dans les analyses de laboratoire clinique. Clin. Laboratoire. Rester. Inst. 32, 1–35 (2012).

Google Scholar

Malinauskas, RA Techniques de mesure de l'hémoglobine plasmatique pour l'évaluation in vitro des lésions sanguines causées par les dispositifs médicaux. Artif. Organes 21, 1255-1267 (1997).

Article CAS PubMed Google Scholar

Roggan, A., Friebel, M., Dörschel, K., Hahn, A. & Müller, G. Propriétés optiques du sang humain en circulation dans la gamme de longueurs d'onde de 400 à 2 500 nm. J. Biomed. Opter. 4, 36–46 (1999).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Taparia, N., Platten, KC, Anderson, KB & Sniadecki, NJ Une approche microfluidique pour la détection de l'hémoglobine dans le sang total. AIP Adv. 7, 105102 (2017).

Article ADS CAS Google Scholar

Merchant, M., Hammack, T., Sanders, P. & Dronette, J. Méthode rapide et peu coûteuse pour la détermination spectroscopique de l'activité immunitaire innée des crocodiliens. Spectrosc. Lett. 39, 337–343 (2006).

Article ADS CAS Google Scholar

Vieira, TO & Diré, GF Analyse spectrophotométrique et hémolytique d'un extrait de Costus spicatus. EJBMSR 3, 29–58 (2015).

Google Scholar

Shah, JS, Soon, PS & Marsh, DJ Comparaison des méthodologies pour détecter de faibles niveaux d'hémolyse dans le sérum pour une évaluation précise des microARN sériques. PLoS ONE 11, e0153200 (2016).

Article PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Liu, P., Zhu, Z., Zeng, C. & Nie, G. Spectres d'absorption spécifiques de l'hémoglobine à différents niveaux de PO2 : méthode non invasive potentielle pour détecter la PO2 dans les tissus. J. Biomed. Opter. 17, 125002 (2012).

Article ADS PubMed CAS Google Scholar

Zijlstra, WG & Buursma, A. Spectrophotométrie de l'hémoglobine : spectres d'absorption de l'oxyhémoglobine bovine, de la désoxyhémoglobine, de la carboxyhémoglobine et de la méthémoglobine. Comp. Biochimie. Physiol. B Biochem. Mol. Biol. 118, 743–749 (1997).

Article Google Scholar

Vallejos, S. et al. Substrats polymères sensoriels solides pour la quantification du fer dans le sang, le vin et l'eau par une technique RVB évolutive. J. Mater. Chim. A 1, 15435–15441 (2013).

Article CAS Google Scholar

Andrew, W., Hannuna, S., Campbell, N. et Burghardt, T. Identification automatique individuelle des bovins Holstein Friesian via une correspondance sélective des motifs de pelage locaux dans l'imagerie RVB-D. Dans Actes de la Conférence internationale IEEE sur le traitement d'images (ICIP) vols 2016-août 484–488 (IEEE Computer Society, 2016).

Bhole, A., Falzon, O., Biehl, M. & Azzopardi, G. Un pipeline de vision par ordinateur qui utilise des images thermiques et RVB pour la reconnaissance des bovins Holstein. Dans Lecture Notes in Computer Science (y compris les sous-séries Lecture Notes in Artificial Intelligence et Lecture Notes in Bioinformatics) Vol. 11679 108–119 (Springer Verlag, 2019).

Jorquera-Chavez, M. et al. Modélisation et validation de techniques de vision par ordinateur pour évaluer la fréquence cardiaque, la température oculaire, la température à la base de l'oreille et la fréquence respiratoire chez les bovins. Animaux 9, 1089 (2019).

Article PubMed Central Google Scholar

Philipsen, MP, Dueholm, JV, Jørgensen, A., Escalera, S. & Moeslund, TB Segmentation d'organes dans les viscères de volaille à l'aide de RGB-D. Capteurs (Suisse) 18, 117 (2018).

Annonces d'article Google Scholar

Lee, K., Baek, S., Kim, D. et Seo, J. Un indicateur de fraîcheur pour surveiller la détérioration de la poitrine de poulet à l'aide d'une feuille Tyvek® et d'une analyse des couleurs RVB. Emballage alimentaire. Durée de conservation 19, 40–46 (2019).

Article Google Scholar

Tyburski, EA et al. La plate-forme jetable fournit un auto-test visuel et basé sur la couleur de l'anémie au point de service. J.Clin. Investir. 124, 4387–4394 (2014).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Edwards, P. et al. Spectromètre optique basé sur smartphone pour la mesure spectroscopique de réflectance diffusive de l'hémoglobine. Sci. Rep. 7(1), 12224 https://doi.org/10.1038/s41598-017-12482-5 (2017).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Collings, S. et al. Détection non invasive de l'anémie à l'aide de photographies numériques de la conjonctive. PLoS ONE 11, e0153286 (2016).

Article PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Hasan, MK, Sakib, N., Love, RR & Ahamed, SI Analyse de pixels RVB d'une image vidéo du bout des doigts capturée à partir d'un patient drépanocytaire avec un taux d'hémoglobine faible et élevé en 2017 IEEE 8th Annual Ubiquitous Computing, Electronics and Mobile Communication Conference, UEMCON Vol. 2017. 2018 499–505 (Institut des ingénieurs électriciens et électroniciens Inc., 2017).

Noriega, LM, Rojas, PW & Silva, AS Dépistage de l'hémoglobine à l'aide d'applications de photographie mobile basées sur le cloud. Ing. y Univ. 23(2), 1–22 https://doi.org/10.11144/Javeriana.iyu23-2.hsuc (2019).

Article Google Scholar

Jayakody, JADCA, Edirisinghe, EAGA & Lokuliyana, S. HemoSmart : un appareil non invasif et une application mobile pour la détection de l'anémie. In Cognitive Engineering for Next Generation Computing 93–119 (Wiley, 2021). doi : https://doi.org/10.1002/9781119711308.ch3

Rajmanova, P., Vala, D. & Slanina, Z. Détection des sacs de transfusion hémolytiques dans IFAC Proceedings Volumes (IFAC-PapersOnline) vol. 12 400–404 (Secrétariat de l'IFAC, 2013).

Archibong, E., Konnaiyan, KR, Kaplan, H. & Pyayt, A. Une approche basée sur le téléphone mobile pour la détection de l'hémolyse. Biosens. Bioélectron. 88, 204-209 (2017).

Article CAS PubMed Google Scholar

Lopes, KM et al. Appareil portable pour mesurer des échantillons sanguins hémolysés basé sur la vision par ordinateur et le réseau neuronal. J. Med. Dispositifs Trans. ASME 13, 1–25 (2019).

Google Scholar

Kim, T. et al. Vers des évaluations photométriques comparables aux tests sanguins de laboratoire pour l'anémie en hématologie vétérinaire. J. Biomed. Opter. 21, 107001 (2016).

Article ADS PubMed Google Scholar

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Les auteurs sont reconnaissants au personnel de l'hôpital universitaire vétérinaire Rof-Codina et du RIAIDT-USC, Université de Saint-Jacques-de-Compostelle, pour l'utilisation des installations cliniques et analytiques.

Département d'anatomie, de production animale et de sciences vétérinaires cliniques, Faculté de médecine vétérinaire, Université de Saint-Jacques-de-Compostelle, Campus Terra, 27002, Lugo, Espagne

Belén Larrán, Marta Miranda, Lucas Rigueira et María Luisa Suárez

Hôpital universitaire vétérinaire "Rof-Codina", Faculté de médecine vétérinaire, Université de Saint-Jacques-de-Compostelle, Campus Terra, 27002, Lugo, Espagne

Belén Larrán, Marta Miranda, Lucas Rigueira et María Luisa Suárez

Département de pathologie animale, Faculté de médecine vétérinaire, Université de Saint-Jacques-de-Compostelle, Campus Terra, 27002, Lugo, Espagne

Marta Lopez-Alonso et Víctor Pereira

Institut de recherche en analyse chimique et biologique, Département de chimie analytique, nutrition et bromatologie, Faculté des sciences, Université de Saint-Jacques-de-Compostelle, Campus Terra, 27002, Lugo, Espagne

Carlos Herrero-Latorre

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BL, MLA, MM et CHL ont conçu l'expérience et BL, MLA, MM, CHL, VP, MLS et LR ont mené l'expérience et ont participé à l'obtention de l'échantillon. Les données ont été analysées statistiquement par CHL et le manuscrit a été rédigé par BL, MLA et CHL. Tous les auteurs ont lu et approuvé la version finale du manuscrit.

Correspondance à Marta Miranda.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Larrán, B., López-Alonso, M., Miranda, M. et al. Mesure de l'hémolyse dans le sérum bovin par des méthodes d'images numériques directes UV-VIS et RVB. Sci Rep 12, 13523 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-17842-4

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Reçu : 21 décembre 2021

Accepté : 02 août 2022

Publié: 08 août 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-17842-4

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